二、IEF电泳检测ApoE表型

本法以VLDL为测定样品。首先利用超速离心机自血清中分离VLDL，一方面可去除血清杂蛋白的干扰，另一方面也可达到富集ApoE的作用，因ApoE主要存在于VLDL。

1．仪器与试剂

电泳仪，垂直板式电泳槽，超速离心机，光密度计，大培养皿；主要试剂有：①1.00g/mlNaBr与1.20g/ml NaBr溶液；②脱脂液为乙醇/乙醚混合液（3：1,V/V）；③样品溶解液为0.01mol/l Tris-HCl,pH8.2,内含1%SDS，5%β-巯基乙醇及13%蔗糖；④凝胶贮存液；丙烯酰胺（Acr）30g，NN’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）1.2g，加水至100ml；⑤电极缓冲液：0.01mol/lH₃PO₄（阳极），0.02mol/L NaCl（阴极）；⑥凝胶应用液：PAG浓度为7.5%，内含1.6%两性电解质载体(Ampholyte,pH4.0～6.5,Pharmacia)；⑦0.2%CBBG250染色液；⑧脱色液：甲醇/水/乙酸溶液（5：5：1，V/V）。

2，实验方法

①人血清VLDL的分离；取血清3.0ml，加入固体NaBr使其密度增加至1.30g/ml。在BeckmanL8-80离心机T_i80转头离心管中依次加入密度为1.00g/ml,1.20g/ml的NaBr溶液和1.30g/ml的血清样品，形成1.00～1.30g/ml的不连续密度梯度。10℃，70000r/min超速离心2h，离心后在管顶层可见白色乳状液体，此即为VLDL，小心收集0.3～0.5ml并转移至已准备好的脱脂管内脱脂。②VLDL的脱脂：按Scanu(1971)法进行。先用3：1（V/V）乙醇/乙醚混合液在-20℃脱脂两次，每次9～12h，继用乙醚脱脂1次，2h。每次脱脂后在-15℃离心收集沉淀，3000r/min,15min。末次离心后在管中加入0.01mol/l Tris-HCl,pH8.2，内含1%SDS，2%两性电解质载体，5%β-巯基乙醇及13%蔗糖的溶液60μl，并在室温下孵育30min，最后用氮气吹尽残存的乙醚，此即为IEF电泳的样品。③IEF电泳：按Menzel等（1983）法进行。垂直板PAG浓度为7.5%，内含1.6%pH4.0～6.5的两性电解质载体。电泳凝胶用0.2%CBBG250染色。脱色后至图像清晰后照像扫描。④ApoE表型判定：根据电泳图谱，依据E2、E3、E4各区带光密度比例确认ApoE各表型，如图19-3和表19-1所示。

图19-3 VLDL的IEF-PAGE图

表19-1ApoE表型的鉴定

由于ApoE即有主要异构体，又有次要异构体，有时使表型确定较为困难。一般情况下，应用此法较易确定ApoE纯合子表型，但对于某些杂合子表型的判定要慎重，往往要在色带经过光密度扫描以后，根据两条色带颜色深浅之比才能最后定论。如仍难以确定时，可用唾液酸酶处理VLDL，使次要异构体减少或消失，而有利于表型的判定。