第一节 受体与标记配体的结合分析

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为了体外研究脂蛋白的细胞代谢和脂蛋白受体活性,早在1974年Goldstein和Brown就建立了成纤维细胞125I标记LDL的配体-受体结合分析法。其基本原理是:用放射性同位素(常用125I)标记LDL后,与细胞(通常为培养的单层成纤维细胞)、组织或含有LDL-R的制剂一起孵育,使LDL-R与125I-LDL充分结合,形成受体-配体复合物,再除去未结合的125I-LDL,测定结合沉淀物中的放射性。同时检测细胞、组织或受体制剂的蛋白质含量,即可计算出与125I-LDL结合的LDL-R量。本法由于使用同位素,采样困难和操作过程繁琐,且费时、昂贵,故在临床诊断上难以广泛开展。

Teupser等于1996年建立了直接荧光法检测LDL-R,他们采用1,1’二(十八烷基)-3,3',3',3'-四甲基吲哚羰基花青高氯酸盐(1,1'-dioctadecy1-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate,DiI)标记LDL,原理与同位素标记LDL相同。其操作步骤见图20-1。直接荧光法可定量检测附着的或非附着的各种类型的培养细胞(如正常人或FH病人的皮肤成纤维细胞、淋巴细胞、人U-937和鼠P388D1巨噬细胞系)的LDL-R和清道夫受体,其特点是特异性强,灵敏度高,不使用有机溶剂、不需预先进行脂质抽提,并省去了多步抽提步骤。正常人平均最大结合浓度为10.3±1.1μg/mg细胞蛋白,FH杂合子为5.2±0.8μg/mg细胞蛋白,FH纯合子0.9±0.2μg/mg细胞蛋白。

直接荧光法测LDL-R操作步骤

图20-1 直接荧光法测LDL-R操作步骤

亦有用胶体金标记LDL的,但是在受体-配体结合分析法中,正常人与FH患者的测定值有较明显的交叉现象,且操作比较繁琐。

1987年Roach等比较了在硝化纤维素上用125I-LDL、生物素-LDL、生物素-LDL、胶体金-LDL和胶体金-LDL结合银染四种方法检测LDL-R,发现胶体金-LDL结合银染的方法最为敏感,且安全、简单、快速、便宜。比较结果见表20-1。

表20-1 硝化纤维上检测LDL-R的几种方法比较

因素125I-LDL生物素-LDL胶体金-LDL胶体金-LDL加银染
时间12~24h3h5~10min20min
敏感性1.6fmoles1.6fmoles1.6fmoles193amoles
线性范围0.5~15μg0.5~4μg0.5~4μg0.06~2μg

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