三、弹性蛋白的提取
提取方法较多,各有优缺点。1969年Bornstein和Ross先用5mol/L盐酸胍抽提,再用胶原酶水解其他非弹性蛋白组分,最后还原二硫键,分离提取弹性蛋白。具体方法如下:
1.将动脉血管壁洗净,小心除去附着结缔组织。
2.将血管壁组织浸于4℃ 50%的吡啶液,破碎组织,3kr/min离心15min。
3.取沉淀用蒸馏水洗涤3次,真空干燥后研成粉末。
4.将粉末悬浮于2mol/L NaCl,4℃搅拌24h,3kr/min离心20min,弃上清,沉淀用蒸馏水洗3次。
5.将沉淀用无水乙醇脱脂20min,用氯仿-甲醇(2:1)处理20min,再用乙醚冲洗干燥,3kr/min离心20min,真空干燥沉渣。
6.干燥的沉淀物用5倍处理液(0.5mol/LCaCl2、10.05mol/l Tris-HClpH7.5、2%胶原酶)洗涤,3kr/min离心20min。
7.将沉淀移入带塞的瓶中,加含0.5mol/L盐酸胍、0.1mol/l Tris-HClpH8.5、0.05mol/L二硫赤藓糖醇,2.0mol/L EDTA液4℃过夜。
8.3kr/min离心20min,沉淀用蒸馏水洗涤2次。
9,沉淀物加入处理液(6mol/L尿素、0.1%SDS、0.05mol/L二硫赤藓糖醇、0.05mol/l Tris-HCl pH7.7),通过氮氧真空过夜,3kr/min离心20min。
10.沉淀再真空干燥,即为弹性蛋白。
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