四、含重组质粒的细胞菌落的鉴定

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含重组质粒的细胞菌落常用的鉴定方法有:①小规模制备质粒DNA进行限制酶切分析;②α互补;③插入失活;④杂交筛选。下面简要介绍小规模制备质粒DNA进行限制性酶切分析。小规模制备质粒DNA可用天美等公司的Wizard Minipreps DNA试剂盒或采用下述方法:

1.挑取一些独立的转化菌落进行小规模培养,用无菌牙签或挑种环挑取单菌落于2ml含有相应抗生素的LB液体培养基中,于37℃剧烈振摇下培养过夜。

2.将1.5ml培养物倒入微量离心管中,用微量离心机于4℃以12000g离心30s,将剩余的培养物贮存于4℃。

3.吸取培养液,使细菌沉淀尽可能干燥。

4.将细菌沉淀重悬于200μl溶液Ⅰ中,剧烈振荡。

溶液Ⅰ 25mmol/L Tris·HCl(pH8.0)

10mmol/LEDTA(pH8.0)

溶液Ⅰ可成批配制,每瓶约100ml,高压下101bf/m2(6.895×104pa)蒸气灭菌15min,贮存于4℃。

5.加200μl新配制的溶液Ⅱ。

溶液Ⅱ 0.2mol/L NaOH

1% SDS

盖紧管口,快速颠倒离心管5次,以混合内容物。应确保离心管的整个表面均与溶液Ⅱ接触。不要振荡,将离心管放置于冰上。

6.加200μl溶液Ⅲ

溶液Ⅲ 5mol/l 乙酸甲 60ml

冰乙酸11.5ml

水28.5ml

盖紧管口,将管倒置,温和振荡10min,使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀,之后将管置于冰上3~5min。

7.用微量离心管于4℃以12000g离心5min,将上清转移另一离心管中。

8.加等量酚和氯仿,振荡混匀,用微量离心机于4℃以12000g离心2min,将上清转移到另一离心管中。

9.用2倍体积的乙醇于室温沉淀双链DNA,振荡混合,于室温放置2min。

10.用微量离心机于4℃以12000g离心5min。

11.小心吸去上清液,将离管倒置于一张纸巾上,以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。

12.用1ml70%乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀,按步骤1所述方法去掉上清,在空气中使核酸沉淀,干燥10min。

13.用50μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μl/ml)的TE重新溶解核酸,振荡,贮存于-20℃。

14.用适当限制性内切酶分析所得DNA。

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