四、测定方法、标本处理等对测定结果的影响

《临床生物化学》书籍目录

除了生理条件可引起酶测定值的变化外,还有其它一些非病理因素也会引起实验室测定结果的变化。

(一)酶测定方法

酶测定方法大致经过三个历史发展阶段,50年代以前大都使用“固定时间法”,即让酶与底物作用一段固定时间,一般为半小时左右,然后停止酶反应,用光电比色测产物生成量或底物消耗量,从而计算出酶催化反应的平均速度。再据此按各作者自己定义的“单位”向临床报告测定结果。这些所报的单位往往在前面冠以作者的姓名命名,例如ALP根据不同测定方法就有金氏单位、鲍氏单位、国际单位等等。同一标本不同单位结果从表面数值看可以差异很大。如ALP上列三种单位参考值分别为3-13金氏单位,0-3鲍氏单位,20-80国际单位。

50年代中期,国际临床实验室开始采用“连续监测法”,就是习惯上所称的“动态法”。需要使用生化分析仪,可以测酶反应的初速度,其结果远比“固定时间法”所测平均速度准确,在高浓度标本时尤为明显。这样同一疾病患者用两种方法所测酶的结果并不一定平行一致。在疾病急性期,用新法测定结果增加倍数常明显超过老法。例如在肝炎用赖氏法测ALT很少超过参考值上限的十倍。改用新法,在肝炎急性期可得到超过参考值上限数十倍乃至百倍以上的结果,由于后者结果和临床病理变化相一致,结果准确。目前在发达国家中,新法已几乎取代了老法,我国也已开始广泛应用新法。本书各论在讨论各种疾病酶变化时,将主要根据新法加以叙述。用新法也就是“连续监测法”所得结果,目前已基本统一使用1964年国际生化协会所规定的国际单位(IU):即以每分钟能催化1微摩尔底物的酶量为1个国际单位。如表示血清中酶浓度多以U/L表示之,即IL标本(血清)中含的酶量,我国医学界对此表示方法已经熟悉习惯。我国现在规定SI制为计量的法定单位,SI制的酶单位为Katal,即每秒能催化1总分子底物的酶量为1个Katal,此单位不仅我国医学家不熟悉,国际上应用不多,如有可能可同时用两种单位报告结果,或者注明转换系数,即1U=16.67μKatal。

但即使同使用连续监测法,同用IU/L报告结果,不同实验室测定结果仍可出现较大差异。这是因为上述二法是通过测酶催化速度来间接表示酶量高低,而酶催化的速度还受很多其它因素影响。首先是温度,在国际单位定义中并未规定测定温度,而反应速度随温度升高而加速,一般说每增加10℃,反应速度将增加一倍。因此同一标本、同一方法,在37℃所得结果将显著高于30℃。虽然国际临床化学协会(IFCC)推荐30℃为酶测定温度,但临床实验室由于实验工作方便等因素,愈来愈多使用37℃。因此本书各酶测定参考值将以37℃所测结果为准,某些数据如在30℃测定将在结果后面用(30℃)表示。

除温度外,测定时条件的不同也可能引起结果明显差异。最突出例子是ALP测定,用二乙醇胺为缓冲液测出ALP结果比用氨基甲基丙烷为缓冲液的高2-3倍。又如在ALT测定时,如在底物中加入磷酸吡哆醛比不加者结果可增高20%-100%。正因为如此,为防止临床医生产生错觉,认为IU/L结果在国际上应一致。目前实验室常以U/L,而不以IU/L向临床报告。

总之,临床医师在分析酶测定结果(U/L)时应以给报告实验室的参考值为准,盲目套用文献结果或与其它实验室结果相比较,有可能得到不恰当的结论。

前面已提到从70年代以来,随免疫技术发展,出现利用酶的抗原性,通过抗原抗体反应直接测定酶的质量。测定结果不是以U/L报告而是直接用ng/ml,μg/L等报告酶蛋白含量高低。如临床医师看到这样的报告,就可知道此时使用了最新的免疫学方法测酶,其临床意义有可能与前两种方法结果有差异。例如国外公认,同样测CK-MB,用免疫学方法所测结果诊断价值最高,此问题将在后专门叙述。

(二)标本的采集、处理与贮存

在实验室测定酶之前,标本还要经过采集、分离血清和贮存等一系列处理过程。而酶在血中是处于一个动态变化过程,血液离开体内后,还会有一定变化。因此在其中任何一个阶段处理不当,都有可能引起测定值变化。

采取血液标本时最容易引起实验室误差的是抽血不当,或者实验室急于分离血清,因此体外溶血。由于大部分酶在细胞内外浓度差异明显,少量血细胞的破坏就有可能引起血清中酶明显升高。最明显例子是LD,红细胞中LD约为血清的100倍,这样,只要有轻度溶血,如1/100红细胞破坏,就足以使血清中LD升高一倍,常使原为正常的血清LD值超过参考值上限。其它如CK,虽然红细胞中无CK,但含有丰富腺苷酸激酶(AK),进入血清能使某些用“连续监测法”测定CK的值假性升高,红细胞中酶的干扰,不仅表现在溶血影响上,采血后如不及时将血清和血凝块分离,血细胞中酶同样可以透过细胞膜进入血清,所以采血后1-2小时实验室必须及时离心,分离血清。

除非测定与凝血或纤溶有关的酶,一般都不采用血浆而采用血清作为测定标本。大多数抗凝剂都在一定程度上影响酶活性,例如EDTA为金属离子螯合剂,在去除Ca2+同时也去除其中Mg2+、Mn2+等离子,Mg2+是ALP、CK和5′-核苷酸酶(5′-NA)作用的激活剂,其它如草酸盐、枸橼酸盐乃至肝素都对一些酶有一定程度抑制。有必要时,可考虑使用肝素为抗凝剂,在常用抗凝剂中它对酶影响最小的。

酶蛋白不稳定,易失活,ACP是最明显的一个例子。此酶在中性或碱性环境中极不稳定,血液在37℃放置1小时,ACP活性可下降50%。大部分酶在低温中比较稳定,分离血清如不能及时测定,应放冰箱保存,表(7-3)是常用酶在不同温度情况下的稳定性。

从表7-3可看出-25℃将血清冻结并没有太大优点,相反有些酶如ALD、ALT在融冻时被破坏。有文献报道用液氧在-195℃贮存血清,常用酶如ALT、AST、ALP、CK、LD、GGT和AMY,在10个月活性变化不大。个别酶如LD在低温反而不如室温稳定,即所谓的“冷变性”。

表7-3 酶在不同温度储存的稳定性(活性变化小于10%)

室温(25℃)冰箱(0-4℃)冰冻(-25℃)
ALD2天2天不稳定
ALT2天5天不稳定
AST3天1周1月
ALP2-3天2-3天1月
GGT2天1周1月
CHE1周1周1周
LAP1周1周1周
CK1周1周1周
LD1周1-3天1-3天
ICD1天2天1天
AMY1月7月2月
LPS1周3周3周
ACP4小时3天§3天§
亚铁氧化酶I1天2周2周
(铜氧化酶)

※酶不耐融化;

¥ 标本未酸化;

§标本加枸橼酸到pH5

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