二、测定方法

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用放射免疫分析进行测定时分三个步骤,即抗原抗体的竞争抑制反应、B和F的分离及放射性的测量。

(一)抗原抗体反应

将抗原(标准品和受检标本)、标记抗原和抗血清按顺序定量加入小试管中,在一定的温度下进行反应一定时间,使竞争抑制反应达到平衡。不同质量的抗体和不同含量的抗原对温育的温度和时间有不同的要求。如受检标本抗原含量较高,抗血清的亲和常数较大,可选择较高的温度(15~37℃)进行较短时间的温育,反之应在低温(4℃)作较长时间的温育,形成的抗原抗体复合物较为牢固。

(二)B、F分离技术

在RIA反应中,标记抗原和特异性抗体的含量极微,形成的标记抗原抗体复合物(B)不能自行沉淀,因此需用一种合适的沉淀剂使它彻底沉淀,以完成与游离标记抗原(F)的分离。另外对小分子量的抗原也可采取吸附法使B与F分离。

1.第二抗体沉淀法这是RIA中最常用的一种沉淀方法。将产生特异性抗体(第一抗体)的动物(例如兔)的IgG免疫另一种动物(例如羊),制得羊抗兔IgG血清(第二抗体)。由于在本反应系统中采用第一、第二两种抗体,故称为双抗体法。在抗原与特异性抗体反应后加入第二抗体,形成由抗原-第一抗体-第二抗体组成的双抗体复合物。但因第一抗体浓度甚低,其复合物亦极少,无法进行离心分离,为此在分离时加入一定量的与一抗同种动物的血清或IgG,使之与第二抗体形成可见的沉淀物,与上述抗原的双抗体复合物形成共沉淀。经离心即可使含有结合态抗原(B)的沉淀物沉淀,与上清液中的游离标记抗原(F)分离。

将第二抗体结合在颗粒状的固相载体之上即成为固相第二抗体。利用固相第二抗体分离B、F,操作简便、快速。

2.聚乙二醇(PEG)沉淀法最近各种RIA反应系统逐渐采用了PEG溶液代替第二抗体作沉淀剂。PEG沉淀剂的主要优点是制备方便,沉淀完全。缺点是非常特异性结合率比用第二抗体为高,且温度高于30℃时沉淀物容易复溶。

3.PR试剂法是一种将双抗体与PEG二法相结合的方法。此法保持了两者的优点,节省了两者的用量,而且分离快速、简便。

4.活性炭吸附法小分子游离抗原或半抗原被活性炭吸附,大分子复合物留在溶液中。如在活性炭表面涂上一层葡聚糖,使它表面具有一定孔径的网眼,效果更好。在抗原与特异性抗体反应后,加入葡聚糖-活性炭。放置5~10min,使游离抗原吸附在活性炭颗粒上,离心使颗粒沉淀,上清液中含有结合的标记抗原。此法适用于测定类固醇激素,强心糖苷和各种药物,因为它们是相对非极性的,又比抗原抗体复合物小,易被活性炭吸附。

(三)放射性强度的测定

B、F分离后,即可进行放射性强度测定。测量仪器有两类,液体闪烁计数仪(β射线,如3H、32P、14C等)和晶体闪烁计数仪(β射线,如125131I、57Cr等)。

计数单位是探测器输出的电脉冲数,单位为cpm(计数/分),也可用cps(计数/秒)表示。如果知道这个测量系统的效率,还可算出放射源的强度,即dpm(衰变/分)或dps(衰变/秒)。

每次测定均需作标准曲线图,以标准抗原的不同浓度为横坐标,以在测定中得到的相应放射性强度为纵坐标作图(图16-3)。放射性强度可任选B或F,亦可用计算值B/(B+F)、B/F和B/B0。标本应作双份测定,取其平均值,在制作的标准曲线图上查出相应的受检抗原浓度。

放射免疫分析标准曲线示例

图16-3 放射免疫分析标准曲线示例

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