五、温度的控制

要了解此问题，应注意温度对酶活性影响的双重性。首先，化学速度随温度升高而加快，酶反应也不例外。Q₁₀值即温度增加10℃，化学速度的变化率。酶的Q₁₀值约在1.5-2.5之间。

温度与反应速度之间关系，可用Arrhenius方程式来表示：

Logk＝－E/2.303RT+常数

式中k是反应常数，T为绝对温度，R为气体常数。E为活化能也是常数。在酶反应中V＝K·[E]。所以在酶反应中，LogV和1/T作图为一直线，斜率为－E/2.303R。通过每一直线斜率不难计算出该酶反应的活化能E。

但是，测定酶时都需要酶和底物在一定温度下作用一段时间，在此期间，温度有可能使酶失活，不同酶在此方面差异很大，有些酶如胎盘碱性磷酸酶在56℃放置15分钟，活性也不下降，有些酶如酸性磷酸酶，37℃1小时后，失去50％酶活性。酶的稳定性还与其它因素，如作用时间、pH、有无底物、有无其它蛋白等有关。同为碱性磷酸酶，在肝提取液中远不如血清中稳定，37℃作用15分钟后肝中此酶活性将显著下降。又如将血清pH降低在pH6.0以下，血清中酸性磷酸酶将长期稳定。

图17-5　预温15分（37℃，pH9.9）对ALP活性的影响

○与●表示肝ALP活性不预温和预温的变化

△与▲表示血清ALP活性不预温和预温的变化

图17-5形象说明预温过程对酶活性的影响。

目前常规工作实验室越来越多的使用37℃，一些国家已明确推荐使用此温度。这更多地是从实际工作方便来考虑。因为温度升高，反应速度快，灵敏度高。同时延滞时间和测定时间都可能缩短。从而有利于提高工作效率。尤其目前在常规实验室中广泛使用全自动生化分析仪，有高效率的恒温系统，使反应系统很快升温并维持在37℃，可避免温度差异引起的误差。但在37℃时，不可避免地一些酶可能失活。

早期曾推荐使用25℃为酶测定温度，其优点为接近室温，反应体系温度很容易平衡到此温度，这对于当时使用无有效控温系统的分光光度计来测酶活化性有其特别方便之处。但温度低。反应太慢。在有些温热地区，当室温超过25℃时，还需使用降温系统很不方便。因此目前已很少有实验室采用此温度。

IFCC推荐的30℃，兼顾了上述二温度的优点，即保证了一定的反应速度。又无酶失活之扰，此外还有一个上述二温度没有的优点，即可以镓作为此温度的基准物质，纯镓的熔点为29.77℃。保证了测定系统计30℃的高度准确性，而37℃和25℃至今尚无一个最准确的确定方法。

30℃和37℃是目前使用最广泛的二种测定酶的使用的温度。在比较不同实验室测定结果时，一定要注意由此引起来的差异，否则将导致临床诊断的困难和误差。一些作者提出使用二温度间的转换系数使二温度测定结果的比较变为可比。虽然一些作者持怀疑态度，用一个系数能代表所有标本中的变化情况吗？最新研究证实只要所用方法合适，人类血清中酶对温度变化的反应差异不大，在无法统一温度情况下，这还不失为一权宜之计，常用酶的温度转换系数可参见表17-4：

表17-4　常见酶温度转化系数

不论选用何种温度测酶，由于酶反应受温度影响很大，在测定时间内，反应体系的温度变化应控制在±0.1℃内。应用国产普通恒温水浴箱来测酶活性是不合适的，应使用带有搅拌器的高级恒温水浴。