四、核酸一级结构(核苷酸序列sequence)分析

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核酸一级结构分析是基因分析最直接的第一手资料。目前DNA、RNA以及蛋白质的一级结构分析中,DNA的碱基序列分析方法多样、简单、快速。下面就M13噬菌体-双脱氧核苷酸(ddNTP)的DNA测序法介绍如下。

M13是单链DNA噬菌体,转染宿主菌体复制为双链增殖,又以单链形式透出菌体。把待测DNA重组插入双链M13复制型DNA中,经培养扩增,可分离得到单链M13DNA(含待测单链DNA的碱基序列),即复制模板。在待测DNA的3′端人工合成引物,在DNA聚合酶Ⅰ作用下,复制链延长。在ddNTP(2′,3′双脱氧核糖核苷三磷酸)存在下,复制延长随机受阻,形成分子量(长度)大小不等的片段。电泳分离,自显影,读图18-9分析碱基序列。

核酸碱基序列分析

图18-9 核酸碱基序列分析

0.2-0.3mm厚度聚丙烯酰胺-尿素凝胶,高压(1600V)电泳,可分辨一个核苷酸的差异。电泳后干燥凝胶,自显影,自下往上读图,得到5′→3′的合成链碱基序列,其互补链是待测DNA的3′→5′碱基序列。

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