四、核酸一级结构（核苷酸序列sequence）分析

核酸一级结构分析是基因分析最直接的第一手资料。目前DNA、RNA以及蛋白质的一级结构分析中，DNA的碱基序列分析方法多样、简单、快速。下面就M13噬菌体-双脱氧核苷酸（ddNTP）的DNA测序法介绍如下。

M13是单链DNA噬菌体，转染宿主菌体复制为双链增殖，又以单链形式透出菌体。把待测DNA重组插入双链M13复制型DNA中，经培养扩增，可分离得到单链M13DNA（含待测单链DNA的碱基序列），即复制模板。在待测DNA的3′端人工合成引物，在DNA聚合酶Ⅰ作用下，复制链延长。在ddNTP（2′,3′双脱氧核糖核苷三磷酸）存在下，复制延长随机受阻，形成分子量（长度）大小不等的片段。电泳分离，自显影，读图18-9分析碱基序列。

图18-9　核酸碱基序列分析

0.2-0.3mm厚度聚丙烯酰胺-尿素凝胶，高压（1600V）电泳，可分辨一个核苷酸的差异。电泳后干燥凝胶，自显影，自下往上读图，得到5′→3′的合成链碱基序列，其互补链是待测DNA的3′→5′碱基序列。