五、免疫方法测酶质量的临床应用

用免疫学方法测酶质量和经典的测酶活性方法相比，不仅灵敏度高，并可能测定一些以前不易测定的酶。但更为有意义的是：有可能为临床上的应用提供新的资料和信息。从疾病论断的角度来看，至少提供下列三个新的可能性：

（一）酶活性和酶质量变化的不平行

这二者的变化在不少情况下是互相平行的，但在一些情况下可以出现不一致。早在1987年Robert就提出可以用免疫学方法直接测量CK的质量，并声称：“由于RIA法是如此的敏感，并可测定血循环中无活性的CK-MB，毫不奇怪此法可比其它方法更早查出心肌梗死，一般在疼痛3小时就可升高。”此后有些学者在急性心肌梗死时比较测CK-MB活性和RIA法CK-B亚单位的结果，发现二者之间存在着不平行关系。CK-MB活性升高持续较短，3天左右；而CK-B亚单位酶蛋白升高却在7天左右。近几年来发展了用免疫学方法测CK-MB酶质量（mass）方法与测酶活性（activity）方法的结果相比较，在检测心肌坏死上，测质量方法明显优于测活性方法。

国内有人报告了用单扩法测酶活性的方法，测定了在各种患者血中超氧歧化酶（SOD）含量，证实有些患者血中存在着无活性的SOD。

在一些疾病情况下，甚至出现二者变化完全相反的情况。例如在狗实验性胰腺炎，用免疫学方法测弹性蛋白酶浓度，出现迅速而急剧地上升，但同时酶活性却出现平行地下降。作者解释在释放酶蛋白入血同时，有大量酶抑制剂也释放入血，以致出现相互矛盾结果。前面提到的用两种方法测前列腺酸性磷酸酶（PACP）来诊断前列腺癌的阳性率不一致，有作者也认为可能是肿瘤组织合成一些无活性或活性较低的酸性磷酸酶。

如果说在这方面尚有争论，那么在遗传学方面的意义则是比较明确的，将此两大类方法结合起来可以研究酶缺陷遗传疾病的发生机制，用免疫学方法可以测出灭活的酶蛋白量。由于基因缺陷引起的酶缺陷如果仅仅影响酶蛋白合成下降，酶活性与酶蛋白量的比率即所谓的“免疫比活性”无变化；如果由于基因缺陷合成了变异的酶蛋白，则不仅总酶活性下降，免疫比活性也将变化；如果合成了一种活性正常但结构不稳定的酶，则幼稚细胞中酶活性及质量都无变化，而在衰老细胞中将出现酶缺陷。酶稳定性的变异常见于红细胞内酶缺陷症。这是由于红细胞寿命较长，成熟红细胞无细胞核不能制造新蛋白质，所以酶稳定性的缺陷容易在衰老红细胞中表现出来。

在最严重的情况，变异的基因甚至能合成无活性的酶蛋白，如胆碱酯酶遗传变异中，有一类型所谓“不活动等位基因”（“silent”allele）就是典型例子。又如在Lesch-Nyhau综合征中存在这免疫活性但无催化活性的次黄嘌呤转磷酸核糖基酶。

（二）以免疫方法取代测酶活性方法

免疫学方法和经典测酶活性方法相比最突出的优点是：免疫学方法能测定一些不表现酶活性的酶蛋白质，这在以前是不能想象的。首先是各种酶原，还有去辅基酶蛋白（apoenzyme）以及一些灭活的酶蛋白裂解产物等等。例如已有用RIA法测胰蛋白酶原。也有用免疫学方法测定线粒体和胞质谷草转氨酶，这其中包括无酶活性的去辅基谷草转氨酶。

免疫学方法另一特点是特异性高，且不受体液中其它物质，特别是抑制剂、激活剂的干扰。不少蛋白水解酶或者对基质特异性不高，或者易受血中一些蛋白质如α1-抗胰蛋白酶、α２－巨球蛋白的抑制作用。用测酶活性方法不易准确定量甚至无法测定。在近年来用免疫学方法陆续建立了RIA测胰蛋白酶、弹性蛋白酶的方法。

一般说来和测酶活性相比，免疫学方法灵敏度更高一些。一些既往由于方法学灵敏度差，不易测定的酶可以尝试改用免疫学方法，脂肪酶是其中例子之一。经典测酶活性方法由于灵敏度差，酶温育时间长达24小时，几经修改仍需4小时，现已有RIA法脂肪酶试剂盒。近年来随着优生学发展，羊水中各种成分包括酶的测定日益受到重视。例如在Tay-Sachs综合征时，胚胎组织细胞中氨基已糖苷同工酶A或（和）B合成障碍，免疫学方法由于灵敏度高，可以比测酶活性方法早几周在胎儿的羊水中查出此酶的缺陷。

（三）同工酶测定

免疫学方法用于测定同工酶比经典的理化方法简单方便，所以愈来愈多同工酶测定改用免疫学方法，国外已逐步取代电泳或层析法。除上文已提到的CK-MB、LD₁、LD₅测定外，还可用免疫学方法测半乳糖酰基转移酶同工酶A和B，碱性磷酸酶的Regan同工酶。同工酶有可能作为肿瘤的标记物（tumor marker），已证实γγ-烯醇化酶或神经元特异烯醇化酶（NSE）可作为APUD系统肿瘤的一个很好标记物。用RIA测血中NSE在肺小细胞性肿瘤患者中阳性率超过80％，γγ-烯醇化酶在大细胞肺癌阳性率也超过70％。可以预期随科学技术发展，免疫学方法将成为临床上测定同工酶的主要方法。

六、检测同工酶及其亚型的临床意义

从50年代中期开始，临床酶学有了迅速的发展，几乎把当时能测的酶都在临床上试用过，企图通过测定某一种或某几种酶来诊断一些特定疾病或特定组织器官的病变。通过10余年广泛的研究，发现酶测定诊断疾病的特异性并不高，因为机体中各种细胞的代谢有很大的相似性，从临床角度很难说存在着所谓器官特异酶。当时曾有学者想找出一些肿瘤特异酶，但很快发现找不到一种只存在于肿瘤组织并能进入血液而正常组织又不存在的酶。

在此同时，Market等通过对LD在电泳时可分为5个区带的深入研究，在1959年首先提出“isozyme”的术语来描述一类酶，它们催化同一生化反应，但在结构和理化性质上有所不同，目前广泛使用国际生化协会推荐术语“isoenzyme”。我国目前多翻译为同工酶，临床很快将此新概念、新发现用于临床，发现同工酶测定可以弥补上述测酶总活性的不足之处，因为不同同工酶在组织分布、细胞内定位、发生发育方面都可能有所差异，临床可利用这些差异来增加诊断的特异性。目前不论在诊断肿瘤，还是诊断心脏、肝等疾病上都找到一些较总酶活性测定特异性、灵敏度高的同工酶测定项目，同工酶正逐步成为酶学中一个重要分支。

80年代发现某些同工酶从组织进入体液后，进一步变化分为数个不同类型即所谓同工酶的亚型（isoform）。CK-MB的亚型MB₁、MB₂，CK-MM亚型MM₁、MM₂和MM₃在AMI的诊断和溶栓疗效判断上都优于总酶和同工酶。

同工酶是一个复杂的生物现象，至今在分类、概念上尚有一些问题有待研究澄清。从临床诊断角度可将同工酶理解为一个包括有多种能催化相同生化反应的酶族，在这族中虽然不同酶都催化同一反应，但在理化性质上有差异，如它们对底物的亲和性、特异性不同，对抑制剂出现不同的反应，所带电荷、对热耐受性有差异等等。生化学者根据这些差异用各种物理、化学方法将同工酶分离测定，从本质上说这些差异与酶蛋白结构有关，或者是构成酶蛋白的氨基酸在组成或排列次序上出现差异，或者由于二级、三级乃至四级结构不同而造成上述不同的理化性质，同时这些结构差异又可引起酶蛋白抗原性的差异。目前正在大力发展这种用免疫方法测同工酶的技术，并取得明显进展。

同工酶之所以有较高的诊断价值与下面一些因素有关：

首先是某些同工酶有明显的组织分布差异，以目前临床应用最多的CK和LD同工酶而言，CK大量存在于三种肌肉组织中，单独总CK升高很难判断。CK升高的组织来源为：骨骼肌中主要为CK-MM，平滑肌中为CK-BB，心肌中虽然大多数仍是CK-MM，但却含有14％-40％的其它两种肌组织中没有或仅含少量的CK-MB，这样只要能测CK同工酶，根据同工酶变化，不难判断出释放CK的器官或组织。

LD虽然几乎存在于全身各种细胞中，但其五种同工酶在体内分布情况并不相同。如LD₁主要存在于心肌和红细胞中，LD₅则主要存在于肝脏和骨骼肌中，正常血清中同工酶分布为LD₂＞LD₁＞LD₃＞LD₄＞LD₅，这样虽然心脏和肝的多种疾病都能引起总LD升高，但对血清LD同工酶影响却大不相同。如AMI时，LD₁明显增高以致LD₁＞LD₂，肝病时将出现LD₅＞LD₄，AMI患者在LD₁＞LD₂基础上，又同时出现LD₅＞LD₄，可怀疑是否有右心衰竭，引起肝淤血。有些酶的同工酶与上述情况不同，只是细胞内定位不同，临床上有诊断意义的主要是线粒体同工酶，线粒体中有一些酶在结构和性质上往往与细胞质中同工酶有明显差异，临床应用较多的是线粒体AST。轻度病变时，由于线粒体有两层致密的膜，此同工酶很难进入血清，但在细胞坏死病变时，血清中线粒体同工酶常明显升高。近年来发现ALT也存在着两种同工酶，肝脏疾病时ALT经常升高，ALT同工酶测定应该对肝病预后判断有一定价值。

在胚胎期，和器官的发生发育一样，这一时期酶带有早期种族进化的痕迹，与出生后人体的酶往往有差异。当人得肿瘤后，肿瘤细胞可以出现返祖现象，有可能出现胚胎期同工酶，测定这类同工酶有助于诊断肿瘤，例如胚胎期CK主要为CK-BB，约有10％恶性肿瘤患者血清可查出CK-BB，又如一些肿瘤患者血中可查到胎盘性ALP等等。

总之，随着科学技术的发展，测定项目的增加，测定方法的简化，同工酶测定将在诊断疾病、判断疗效和预后方面起着愈来愈大的作用。