一、核酸杂交技术
检验方法建立的基本要素是特异性和灵敏度,在复杂的物体中,使无法感觉的特定物质进入人类的观察范围。核酸杂交检测技术就是利用核酸碱基严格配对的特异性,核酸标记物的灵敏度而建立的检测核酸结构与功能的方法。该法建立以来已有二十年,目前研究实验室用得多,临床实验室用得较少,除成本高外,关键是操作复杂,重复性差,仅能半定量。成本高可随经济发展而缓和,但其它缺点尚需努力克服。
杂交实验的探针应具有特异性,对应不同的杂交方法靶基因(被检基因)应有一定的纯度与丰度。杂交反应的开始是碰撞,探针浓度高则速率增加,一般32P标记探记探针5-100ng/ml,非放射性探针25-1000ng/ml,原位杂交无论放射还是非放射物标记,一般都需0.1-5.0μg/ml。当探针过量时,杂交速率取决于探针长度,如一个100ng/ml20个核苷酸的合成寡核苷酸探针与1-100pg 1kb长的靶基因杂交,10分钟能达到最大杂交率。而相同条件下2kb的克隆探针需160小时。主要原因是这里所指浓度是重量浓度而非摩尔浓度。长探针因标记量大,小的摩尔浓度已足以达到需要的检测灵敏度。为了促进长探针(>250个核苷酸)的杂交速率,加入杂交促进剂是非常必要的。最常用的是硫酸葡聚糖,使用浓度为5%-10%,浓度过高会增加杂交液粘度。聚乙二醇也作为促进剂,价廉且粘度低,但检测本底太高。另外杂交的温度、盐浓度、甲酰胺浓度可调节杂交分子形成的稳定性。理论选用DNA:DNA杂交温度T=Tm-25℃,此时杂交分子最易形成。但具体实验中影响Tm值的因素很多,一般杂交温度低,形成的杂交分子较稳定。RNA:DNA杂交分子的Tm大10-15℃,RNA:RNA杂交分子的Tm大20-25℃,使得杂交温度提高,此时需调节甲酰胺浓度来调节杂交温度。好的实验条件最终应在实践中摸索建立。
(一)斑点杂交
将少量核酸样品点样在硝酸纤维素滤膜上,80℃烘烤后可牢固地固定在膜上,再用探针进行杂交。尼龙膜,特别是聚偏氟乙烯膜(PVDF)与DNA结合力更高,坚韧、易操作。点样可手工,也可用真空点样品。检测可用放射性探针自显影或非放射性探针显色。可用于DNA或RNA分析。下面以非放射性探针分析DNA为例,结果是显色。
取硝酸纤维素膜和滤纸在2xSSC(NaCl 300mmol/L,柠檬酸钠30mmol/L),pH7.0浸15分钟,平铺滤纸在点样抽滤器上,再铺上硝酸纤维滤膜,真空抽气使点样器减压,膜显出凹面。点样50μl(5-10μgDNA,可直接点血清样品)于凹面,撤去真空,把膜晾干。取滤纸浸0.5mol/l NaOH,1.0mol/l NaCl,把膜平铺于滤纸上20分钟,变性。取滤纸二张分别浸在0.5mol/l Tris-Hcl pH7.5和1.0mol/l Tris-HCl,0.6mol/l NaCl pH7.5,分别依次把膜平铺于滤纸上,各中和15分钟,中和后膜的pH为7.2-7.5。于80℃,30-45分钟烘干。(RNA分析点样缓冲液系统不同,无需变性,中和,余大致相同)用塑料封口机把膜和2.5ml预杂交缓冲液封入塑料袋中,42℃,水浴30分钟。
预杂交缓冲液: | 65℃6xSSC | (原液:20xSSPE) |
5xDenhardt | (50xDenhardt) | |
0.5%SDS | (10%SDS) | |
100μg/ml变性鲑精DNA片段 | (1mg/ml) | |
42℃增加50%甲酰胺 | (原液),配成20ml. |
50xDenhardt:5g聚蔗糖(Ficoll,400型,Parmacia),5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白(组份Ⅴ,Sigma)加水至500ml。过滤后-20℃保存。
探针2ml(50-100ng/2ml预杂交缓冲液)于100℃,10分钟,马上置冰浴5分钟(变性)。加入袋封口。42℃水浴过夜。去杂交液(可回收)。以2xSSC,0.1%SDS15ml,50℃5分钟洗二次。0.1SSC,0.1%SDS洗二次。封闭:另取袋封入膜和封闭液(蛋白质50mg/ml,100mmol/l Tris-HCl(pH7.5)/150mmol/LNaCl)2.5ml,37℃,30分钟。去封闭液(可回收)。100mmol/lTris-HCl(pH7.5)/150mmol/L NaCl ,15ml,5分钟洗二次。亲和反应:酶标抗体3ml(酶有碱性磷酸酶、过氧化物酶等,标记物有抗地高辛、生物素等,现以地高辛标碱性磷酸酶为例4μg/3ml 100mmol/L Tris-HCl,150mmol/l MgCl2,10mg/ml牛血清白蛋白),封入袋中37℃,30分钟。100mmol/l Tris-Hcl,100mmol/l NaCl,50mmol/l MgCl2,pH9.5,10ml,1分钟洗一次。取硝基四氮唑兰(NBT)75mg/ml 70%二甲基甲酰胺25μl,4-溴-5-氯-3-吲哚磷酸50mg/ml二甲基甲酰胺20μl(底物)和100mmol/l Tris-HCl,100mmol/l NaCl,50mmol/l MgCl2,pH9.56ml混匀,37℃,避光反应三小时,显色。蒸馏水洗膜,晾干。观察结果。
(二)Southern blot
1975年E.Southern发明了将DNA切开,电泳分离,再变性,印迹到硝酸纤维(Nc)滤膜上,用探针进行杂交,检测DNA的方法。自显影或显色用于DNA分析。以32P标记放射性探针为例,放射自显影观察结果。(图18-6)。
图18-6 Southernblot体系
前述分离、纯化的DNA样品5-10μg/100μlTE,加限制性内切酶3Unit/1μgDNA和内切酶相应缓冲液,在相应温度保温1-3小时(不同的酶所用的缓冲液和温度不同),乙醇沉淀,15-20μl TE溶解DNA断片。前述电泳条件,与DNA分子量标准品(Marker,Ladder)一起,3-4V/cm电泳(30V12-15小时)。在紫外光下观察Marker充分分离,结束电泳。将胶放入0.5mol/l NaCl,0.5mol/L NaOH液体中30分钟,使DNA变性。同时将膜用蒸馏水浸润,在0.5mol/L NaCl,0.5mol/L NaOH液体的方盘皿上,放上滤纸两头浸在液体中,依次放上凝胶、膜、滤纸、一尺厚的吸水纸,压力1kg的重物。转移(印迹,blot)过夜。翌日,把膜放在0.5mol/l Tris-HCl,pH7.0-7.5,1mol/L NaCl液中,中和膜上碱性变性液15-30分钟。戴上手套,用手指压在膜上来回充分洗膜。室温干燥一小时。用塑料封口机,把膜和预杂交缓冲液封在塑料口袋中,注意驱除袋内汽泡。热水浴过夜。探针变性后,加入袋中再封口。热水浴过夜。
洗膜: | 2xSSPE,0.5%SDS,总体积200ml,室温30分钟。 |
0.4%xSSPE,0.5%SDS,总体积200ml,60℃,30分钟。 | |
将膜包入塑料袋,在暗室贴在X光底片上。-70℃,自显影1-2天。 | |
冲片显影,观察结果(背景不清晰可重新洗膜再显影)。 |
(三)Northern blot
用于RNA分析,电泳条件与转膜方法与Southern blot不同外,RNA不必变性与中和,电泳时加电醛防止RNA发夹结构形成。其它步骤相同。
为了防止RNase水解需分析的mRNA,尽可能将器皿在160-180℃干热灭菌8小时以上,也可加0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)泡2小时,灭菌水淋洗干净,100℃干烤15分钟。不能干热灭菌的试剂等,也可加1%DEPC处理12小时(但不能用于Tris)后,100℃。加热15分钟(或高压灭菌15分钟)以抑制、分解RNase。1.0g琼脂糖,灭菌水80ml加热溶解。加x50TAE2ml,EB25μl,灭菌水至1000ml。样品缓冲液,x50TAE20μl,50%去离子甲酰胺500μl,甲醛180μl,混匀。约10-30μg/10μl纯化的RNA样品,加二倍(20μl)样品缓冲液(可点样一个凝胶孔lane)。60℃水浴15min,马上置冰浴。加1/10电泳指示剂。点样电泳,75-80V电泳4-5小时(指示剂泳动7~8cm),结束电泳。电泳期间正负极缓冲液要不断交换(可用蠕动泵),以免pH改变。电泳结束,将凝胶放在紫外光下可观察到人rRNA大亚基28S(5.1kb),小亚基18S(2.0kb),记下大小亚基移动距离(或拍照),可作为被测mRNA分子量分析的参照物。凝胶在50mmol/l NaOH中变性30分钟(低浓度碱,此步可省)。膜在10xSSPE中浸20分钟。用10xSSPE转移过夜(同Southern blot)。80℃1-2小时干燥。用探针杂交后,显影或显色。
(四)原位杂交(insituhybridization)
在保持细胞形状条件下,进行细胞内杂交,显影或显色。用于DNA或RNA分析。
细胞用离心涂片机涂片或组织切片置于载玻片上。4%多聚甲醛(PFA)/PBS固定(固定时间因标本而异10-20分钟,也可用含2%甲醛,0.05%戊二醛,2.5mmol/lCaCl2的0.1mol/L磷酸缓冲液pH7.3,500W微波炉中照射10-20秒,固定)。马上用PBS洗标本三次,2.5μg/ml蛋白酶K,37℃,5-20分钟(因标本和固定条件而定)处理。磷酸盐类缓冲液(PBs NaCl 137mmol/l,KCl 2.7mmol/L,Na2HPO48.1mmol/L,KH2PO41.5mmol/L)洗涤。4%PFA/PBS后固定,PBS洗一次,0.2%甘氨酸/PBS洗二次,每次15分钟。预杂交:42℃,1小时。预杂交缓冲液:10%硫酸葡聚糖,10%Denhardt液,0.5%吐温-20,250μg/ml鲑鱼精子DNA,500μg/ml酵母tRNA。杂交:42℃,4小时。用2x杂交缓冲液(4xSSC,0.2mol/L磷酸钠pH6.5,2xDenhardt)溶解已标记探针,使其终浓度为0.1-1.0μg/ml。DNA检测时把探针覆盖在标本上,置100℃5分钟(变性)取出,杂交。mRNA检测则先把探针置95℃水浴3分钟,立即置冰水浴,再覆盖标本上进行杂交。覆盖标本用液量100-200μl洗涤:2xSSC,50℃过夜。0.2xSSC,室温1小时。载玻片浸在缓冲液中。显色(试剂、方法参照斑点杂交的封闭-显色部分)20分钟-2小时,显微镜下观察结果。
- 核酸杂交技术《临床生物化学》
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- 核酸限制性片段长度多态性(RFLP)分析《临床生物化学》
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- 核酸外切酶《实用免疫细胞与核酸》
- 核桃风《解围元薮》
- 核酸探针的种类《基因诊断与性传播疾病》
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- 核酸探针的种类《实用免疫细胞与核酸》
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- 核酸探针的非放射性标记技术《实用免疫细胞与核酸》
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- 核外电子的排布规律《医用化学》
- 核酸分子杂交技术《实用免疫细胞与核酸》
- 核外电子的运动状态《医用化学》
《临床生物化学》
- 第一章 绪论
- 第二章 蛋白质与临床诊断
- 第一节 健康与疾病时的血浆蛋白质
- 第二节 细胞骨架蛋白——组织特异性蛋白的鉴定及其意义
- 第三节 细胞调节因子
- 第三章 糖代谢紊乱
- 第四章 血浆蛋白及其代谢紊乱
- 第五章 体液平衡紊乱
- 第一节 体液平衡及调节
- 第二节 血气分析
- 第三节 体液平衡紊乱
- 第四节 酸碱平衡紊乱
- 第五节 酸碱平衡紊乱典型病例检验结果分析
- 第六节 体液钾钠氯测定及方法学评价
- 第六章 钙磷镁与微量元素的临床生物化学
- 第一节 钙、磷代谢及其异常
- 第二节 镁代谢及其异常
- 第三节 微量元素的作用及其与疾病的关系
- 第七章 诊断酶学
- 第一节 概述
- 第二节 临床诊断中常用的血清酶类及其同工酶
- 一、肌酸激酶(CK)及其同工酶
- 二、乳酸脱氢酶(LD)及其同工酶
- 三、氨基转移酶(ALT,AST)及其同工酶
- 四、碱性磷酸酶(ALP)
- 五、γ-谷氨酰基转移酶及其同工酶
- 六、淀粉酶(AMY)及其同工酶
- 七、酸性磷酸酶(ACP)及其同工酶
- 第三节 缺血性冠状动脉疾病的酶学诊断
- 第四节 肝脏疾病的酶学诊断
- 第八章 肿瘤标志物的临床实验室检查
- 第九章 治疗药物监测
- 第一节 概论
- 第二节 药代动力学基础及有关参数的应用
- 第三节 合理使用治疗药物监测应考虑的基本因素
- 第四节 治疗药物监测的临床应用
- 第五节 治疗药物监测常用标本及预处理
- 第六节 药物浓度测定常用技术
- 第七节 需测定药物浓度进行监测的主要药物
- 第十章 肝胆疾病的生物化学与实验诊断
- 第一节 概述
- 第二节 肝的生物转化功能
- 第三节 肝与胆汁酸代谢
- 第四节 胆红素代谢与黄疸
- 第五节 某些肝病的生化机制
- 第六节 肝细胞损伤时的肝功能试验
- 第十一章 肾功能不全的实验室生物化学诊断
- 第一节 概述
- 第二节 常见肾脏疾病的病理生物化学
- 第三节 肾功能不全的生化诊断及评价
- 第十二章 内分泌疾病的生物化学诊断
- 第一节 概述
- 第二节 甲状腺功能紊乱的临床生化
- 第三节 肾上腺功能紊乱的临床生化
- 第四节 下丘脑-垂体内分泌功能紊乱的临床生化
- 第五节 性激素紊乱的临床生化
- 第十三章 神经、精神疾病的生物化学
- 第一节 概述
- 第二节 某些神经疾病的生物化学
- 第三节 精神性疾病的生物化学
- 第四节 神经、精神疾病生化诊断
- 第十四章 妊娠的临床生物化学
- 第十五章 遗传性疾病的生物化学与分子生物学诊断
- 第十六章 常用分析技术在临床生物化学中的应用
- 第一节 光谱分析技术的应用
- 第二节 电泳技术的应用
- 第三节 离心技术的应用
- 第四节 层析技术的应用
- 第五节 电化学分析技术的应用
- 第十七章 血清酶定量的检测技术
- 第一节 概述
- 第二节 酶活性测定的常用技术和方法
- 第三节 酶活性测定条件的选择和限定
- 第四节 测定酶活性浓度的两大类方法
- 第十八章 诊断分子生物学基本技术
- 第一节 概述
- 第二节 分子生物学实验基础
- 第三节 分子生物学实验诊断技术
- 第四节 诊断分子生物学技术的临床应用
- 第十九章 临床生物化学分析仪的性能与应用
- 第一节 临床生化自动分析仪的类型
- 第二节 临床生化自动分析仪的性能评价与合理选用
- 第三节 临床生化自动分析的方法
- 第二十章 临床生物化学方法的选择、建立和评价
- 第一节 临床生化方法的选择
- 第二节 临床生化方法的建立
- 第三节 临床生化方法学的评价
- 第四节 临床生化方法学性能判断
- 第二十一章 临床生物化学检验质量控制
- 第二十二章 临床生物化学实验室数据的作用和有效使用