二、核酸扩增技术
通过大肠埃希菌繁殖而增殖重组质粒,也是扩增核酸的手段。但在试管中有效扩增DNA的方法,是在90年代才开展起来的多聚酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)新技术。由于PCR灵敏度高、特异性好、操作方便,在我国发展很快。目前,PCR技术结合分子生物学实验技术(如逆转录反应杂交技术等)开发了许多PCR新技术(reverse transcriptase PCR;PCR-single strandconformation polymorphism,PCR-SSCP;巢式PCR(二次PCR);热启动PCR等)。RT-PCR用于RNA分析;PCR-SSCP分辨率高,可用于点突变分析;二次PCR特异性好,灵敏度高;热启动PCR可提高特异性。
PCR技术原理是在了解DNA一级结构基础上设计引物(primer或sense,人工合成),DNA多聚酶可识别并结合引物,以单链DNA为模板,dNTP为底物,合成其互补链。通过反复变性,反复合成互补链的过程,达到DNA扩增的目的。人的DNA扩增引物长度多为20个核甘酸。(图18-7)
图18-7 PCR技术原理
PCR反应:DNA样品0.1-1μg,引物1,2各25-100pmol,dNTP各200μmol/L,Tris-HCl(pH8.3)10mmol/L,KCl 50mmol/L,MgCl21.5mmol/L,gelatin(明胶)0.01%,Taq多聚酶2.5-5U,矿物油一滴。93℃7分钟→50-55℃2分钟→70-72℃3-1.5分钟→93℃2分钟。
将反应物和Marker点样于凝胶一起电泳,紫外光下观察结果,拍照保存结果。反应物也可用于印迹(杂交)实验、多态分析、探针制备等。
注意事项:①DNA样品纯度高,Taq酶(和Klenow酶)有逆转录酶活性,DNA和RNA不能混在一起。②设计的引物分子内(特别3′端)和引物,1,2分子间不形成双链。选择性好,不增幅目的DNA以外区域的DNA。引物的G+C含量为40%-60%。③dNTP浓度过高易使Taq酶合成错误,一般在200μmol/L,有人建议40-50μmol/L。④KCl>75mmol/L对酶有抑制作用。Mg2+浓度过高,NDA不易变性,>10mmol/L可抑制酶活性40%-50%。⑤多聚酶:Taq多聚酶从嗜热菌分离得到(1989年,在此以前1985年利用Klenow酶因不耐热每经过一次热变性要补加一次酶),现在经基因克隆的重组体产物Taq酶最适pH8.3~8.8(室温8.3-8.4),反应温度75-80℃,95℃以上失活明显。无3′→5′校读活性,对SDS敏感(<0.01%活性也受到抑制,加吐温-20可抵制SDS抑制)。该酶有逆转录酶活性。⑥退火温度一般设定为Tm-5℃,但实际上与引物一级结构序列有关,设计不当可造成非特异性退火,而造成非特异扩增,此时应调整温度和相应的时间。⑦循环次数受到的影响因素较多,增加次数可提高灵敏度,但易出现非特异扩增。⑧PCR灵敏高,被检样品极易被污染,样品纯化,扩增,检测区域应分开。房间应经常用紫外光照射。扩增物应定点丢弃,处理。
- 核酸扩增技术《临床生物化学》
- 核酸及蛋白质常用数据《实用免疫细胞与核酸》
- 核酸酶S1《实用免疫细胞与核酸》
- 核酸分子杂交实验因素的优化《实用免疫细胞与核酸》
- 核酸探针的标记和检测《基因诊断与性传播疾病》
- 核酸分子杂交技术《实用免疫细胞与核酸》
- 核酸探针的标记和检测(详见每十九章 )《实用免疫细胞与核酸》
- 核酸分子杂交方法《基因诊断与性传播疾病》
- 核酸探针的常用酶促标记技术《实用免疫细胞与核酸》
- 核酸分子杂交法《基因诊断与性传播疾病》
- 核酸探针的非放射性标记技术《实用免疫细胞与核酸》
- 核酸分子杂交的类型《实用免疫细胞与核酸》
- 核酸探针的种类《实用免疫细胞与核酸》
- 核酸的一级结构《实用免疫细胞与核酸》
- 核酸探针的种类《基因诊断与性传播疾病》
- 核酸的理化性质《基因诊断与性传播疾病》
- 核酸外切酶《实用免疫细胞与核酸》
- 核酸的结构与功能《生物化学与分子生物学》
- 核酸限制性片段长度多态性(RFLP)分析《临床生物化学》
- 核酸的化学组成《实用免疫细胞与核酸》
- 核酸一级结构(核苷酸序列sequence)分析《临床生物化学》
- 核酸的化学组成《生物化学与分子生物学》
- 核酸杂交法《生物化学与分子生物学》
- 核酸的化学组成《医学遗传学基础》
- 核酸杂交技术《临床生物化学》
- 核酸的高级结构《实用免疫细胞与核酸》
- 核糖含量测定《中国生物制品规程》
- 核酸的分子杂交《实用免疫细胞与核酸》
- 核糖核蛋白体《生物化学与分子生物学》
- 核酸的分离与纯化《临床生物化学》
- 核桃《老年食养食疗》
《临床生物化学》
- 第一章 绪论
- 第二章 蛋白质与临床诊断
- 第一节 健康与疾病时的血浆蛋白质
- 第二节 细胞骨架蛋白——组织特异性蛋白的鉴定及其意义
- 第三节 细胞调节因子
- 第三章 糖代谢紊乱
- 第四章 血浆蛋白及其代谢紊乱
- 第五章 体液平衡紊乱
- 第一节 体液平衡及调节
- 第二节 血气分析
- 第三节 体液平衡紊乱
- 第四节 酸碱平衡紊乱
- 第五节 酸碱平衡紊乱典型病例检验结果分析
- 第六节 体液钾钠氯测定及方法学评价
- 第六章 钙磷镁与微量元素的临床生物化学
- 第一节 钙、磷代谢及其异常
- 第二节 镁代谢及其异常
- 第三节 微量元素的作用及其与疾病的关系
- 第七章 诊断酶学
- 第一节 概述
- 第二节 临床诊断中常用的血清酶类及其同工酶
- 一、肌酸激酶(CK)及其同工酶
- 二、乳酸脱氢酶(LD)及其同工酶
- 三、氨基转移酶(ALT,AST)及其同工酶
- 四、碱性磷酸酶(ALP)
- 五、γ-谷氨酰基转移酶及其同工酶
- 六、淀粉酶(AMY)及其同工酶
- 七、酸性磷酸酶(ACP)及其同工酶
- 第三节 缺血性冠状动脉疾病的酶学诊断
- 第四节 肝脏疾病的酶学诊断
- 第八章 肿瘤标志物的临床实验室检查
- 第九章 治疗药物监测
- 第一节 概论
- 第二节 药代动力学基础及有关参数的应用
- 第三节 合理使用治疗药物监测应考虑的基本因素
- 第四节 治疗药物监测的临床应用
- 第五节 治疗药物监测常用标本及预处理
- 第六节 药物浓度测定常用技术
- 第七节 需测定药物浓度进行监测的主要药物
- 第十章 肝胆疾病的生物化学与实验诊断
- 第一节 概述
- 第二节 肝的生物转化功能
- 第三节 肝与胆汁酸代谢
- 第四节 胆红素代谢与黄疸
- 第五节 某些肝病的生化机制
- 第六节 肝细胞损伤时的肝功能试验
- 第十一章 肾功能不全的实验室生物化学诊断
- 第一节 概述
- 第二节 常见肾脏疾病的病理生物化学
- 第三节 肾功能不全的生化诊断及评价
- 第十二章 内分泌疾病的生物化学诊断
- 第一节 概述
- 第二节 甲状腺功能紊乱的临床生化
- 第三节 肾上腺功能紊乱的临床生化
- 第四节 下丘脑-垂体内分泌功能紊乱的临床生化
- 第五节 性激素紊乱的临床生化
- 第十三章 神经、精神疾病的生物化学
- 第一节 概述
- 第二节 某些神经疾病的生物化学
- 第三节 精神性疾病的生物化学
- 第四节 神经、精神疾病生化诊断
- 第十四章 妊娠的临床生物化学
- 第十五章 遗传性疾病的生物化学与分子生物学诊断
- 第十六章 常用分析技术在临床生物化学中的应用
- 第一节 光谱分析技术的应用
- 第二节 电泳技术的应用
- 第三节 离心技术的应用
- 第四节 层析技术的应用
- 第五节 电化学分析技术的应用
- 第十七章 血清酶定量的检测技术
- 第一节 概述
- 第二节 酶活性测定的常用技术和方法
- 第三节 酶活性测定条件的选择和限定
- 第四节 测定酶活性浓度的两大类方法
- 第十八章 诊断分子生物学基本技术
- 第一节 概述
- 第二节 分子生物学实验基础
- 第三节 分子生物学实验诊断技术
- 第四节 诊断分子生物学技术的临床应用
- 第十九章 临床生物化学分析仪的性能与应用
- 第一节 临床生化自动分析仪的类型
- 第二节 临床生化自动分析仪的性能评价与合理选用
- 第三节 临床生化自动分析的方法
- 第二十章 临床生物化学方法的选择、建立和评价
- 第一节 临床生化方法的选择
- 第二节 临床生化方法的建立
- 第三节 临床生化方法学的评价
- 第四节 临床生化方法学性能判断
- 第二十一章 临床生物化学检验质量控制
- 第二十二章 临床生物化学实验室数据的作用和有效使用