第四节　抗血清中抗体的纯化

单价特异性是指血清只与其特异性抗原发生反应。有时免疫原不纯，含有微量的杂抗原（性质相近的），制得的抗血清中出现2～3种杂抗体。即使用纯抗原，例如用高度纯化的IgG免疫动物，出现的抗体总是有抗γ重链的抗体，也有抗κ轻链和抗λ轻链的抗体。还有一种情况，有些蛋白质和其他蛋白质处于一种结合状态，如甲胎蛋白常和白蛋白相结合，因此免疫得到的抗血清总是有抗白蛋白杂抗体存在。

一、除去杂抗体有两种方法：

1．亲和层析法将交叉杂抗原交联到琼脂糖珠4B上，如除去抗白蛋白抗体，则交联上白蛋白或不含甲胎蛋白的血清，装柱后，将预吸收的抗体通过亲和层析柱，杂抗体吸附在柱上，流出液则是单价特异性抗体。

2．吸附剂方法用不含特异性抗原的抗原液，即不含用于免疫动物抗原的其他杂抗原液，如血清、组织液或已知的某种杂抗原，用双功能试剂将其交联，做成固相吸附剂。如用不含甲胎蛋白的血清，稀释1倍后，加入0.25％的戊二醛或丙酮醛，放冰箱一夜后，该血清成为胶冻状，用力打碎（或用组织粉碎器），用缓冲液多次洗涤后，则成为颗粒状的凝胶吸附剂。用这种吸附剂直接加到抗血清中（约1/10），抗原则与杂抗体结合，上清液则为无杂抗体的单价特异性抗体。有时因杂抗体太多，必须处理吸收两次才能完全去除。吸附过的凝胶，用3mol/L硫氰酸钾（或钠）洗涤，洗脱掉杂抗体，可再继续使用。

有时杂抗原较少，其他蛋白也少，加入戊二醛后不形成胶冻状，此时可加入无关蛋白进行交联，如牛血清蛋白、兔血清、马血清、卵白蛋白等。加入量以达到含总蛋白的2％～3％为宜。

二、特异性IgG抗体的制备

在标记的免疫测定或其他技术中将特异性抗体纯化出来，是极为重要的。例如在ELISA，用于包被的抗体一定要用特异性IgG，才能得到良好的效果。这是因为全血清中有大量非抗体蛋白，如白蛋白、α1和α2球蛋白等，如不除去，会干扰包被。再如反相间接血凝，致敏红细胞的抗体也需用特异性IgG的I(ab＇)₂才能使实验满意。特异性IgG和F(ab＇)₂的制备方法有如下几种。

（一）粗提法提取球蛋白

大多用硫酸铵盐析法或硫酸钠盐析法。硫酸铵盐析须经过多次沉淀，第一次用40％饱和度，第二次用35％饱和度，第三次用33％饱和度，经三次提取后的γ球蛋白基本是IgG成分。硫酸钠法更简便，用20％即可将γ球蛋白沉淀出来。经盐析后的γ球蛋白虽大多属于IgG，但还有5％其他区带蛋白，如γ区的杂蛋白。又因IgG组分中还含其他所谓正常的IgG，产生干扰。因此盐析法粗提的γ球蛋白只能用于一般的实验，或者是抗体效价较高的抗血清。

（二）离子交换层析法提取IgG

常用的离子交换剂有DEAE纤维素或QAE纤维素，以QAE-Sephadex最为理想，DE22、32、52也可应用。取QAE-SephadexA25或A50经酸处理并在0.05mol/LpH7.5～8.6的磷酸盐缓冲液中平衡，将水分抽干，称湿重Ig加于10ml血清中，在室温30min后，离心或过滤除去离子交换剂。上清液再如此处理一次，即获得较纯的IgG，甚至不含其他杂蛋白。用该技术纯化IgG简便，不损坏抗体，既可小量提取，也可大量制备。

（三）亲和层析法提取特异性IgG

将纯化抗原或粗制抗原（如是单价特异性则对抗原要求不高）交联Sepharose4B制成亲和层析柱，将抗血清过柱后洗去未结合的杂蛋白，再用硫氰酸钾洗脱，流出的是纯的特异性IgG抗体。因硫氰酸钾对抗体有破坏作用，应及时透析除去。纯化的IgG因含量低，失去保护作用，应及时应用或冻干保存，亦可20℃保存，但皆不理想；加入三乙醇胺或甘油可起保护作用。

（四）酶解法制备F(ab＇)₂片段

胃蛋白酶对IgG的作用点是在连接两重链的二硫键靠C端处（232氨基酸处），结果两个Fab由二硫键连接，保留了抗体的结合点。与IgG相比，F(ab＇)₂的特点是去掉了Fc段，这样在细胞免疫实验中免除了受体作用；同时也使IgG失去主要的抗原特性，不被抗IgG抗体结合；在反向间接血凝中，用F(ab＇)₂致敏羊红细胞比用IgG效果好。