三、半抗原免疫原的制备

多肽、甾族激素、药物、脂肪胺、核苷等小分子物质仅能与相应的抗体发生特异性结合反应，而它们自己并不是免疫原，不能诱导抗体产生。只有将这种半抗原与蛋白质或其他高聚物结合后才能刺激机体产生抗体。结合的方法有物理法和化学法。物理吸附的载体有淀粉、聚乙烯吡咯烷酮（PVP），硫酸葡聚糖、羧甲基纤维素等，是通过电荷和微孔吸附半抗原。化学法是利用功能团把半抗原以载体上。

（一）载体选择

1．蛋白质类蛋白质是结构复杂的大分子胶体物质，是一种良好的载体。常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白和血蓝蛋白等。其中以牛血清蛋白最为常用，因其溶解度大，免疫活性强，又容易获得。蛋白质和半抗原结合是通过游离氧基、游离羧基、酚基、巯基、咪唑基、吲哚基和胍基等活性基团的缩合。

2．多肽类聚合物是人工合成的多肽聚合物，常用的是多聚赖氨酸（polylysine）。这种多聚合物与半抗原结合后，可诱发动物产生高滴度、高亲和力的抗体。多聚赖氨酸的分子量可达十几万到几十万，是良好的载体。

3．大分子聚合物和某些颗粒PVP、羧甲基纤维素和活性碳等皆可与半抗原结合，加入福氏完全佐剂可诱发产生良好的抗体。

因半抗原种类、动物类别、载体种类及结合方法的不同，制得的免疫原对动物免疫所产生的效果也不同。实际应用时，应多采用几种载体或方法。

（二）连接方法

半抗原与载体连接要掌握3个基本条件：带游离氨基或游离羧基以及二种基团皆有的半抗原，如多肽激素类（脑啡肽、胃泌素、ACTH、前列腺素等），它们有游离的氨基或羧基。羧基可用混合酸酐法和碳化二亚胺法与载体氨基形成稳定的肽键。同样，带氨基的半抗原则可与载体羧基缩合。亦可用双功能试剂如戊二醛、甲苯2，4-二异酸盐与载体氨基连接。脂肪胺可用碳化二亚胺缩合剂或对硝基苯酰氯反应，把脂肪胺变为对硝基苯酰胺，通过加氢还原为氨基苯酰衍生物，再用重氮化反应。②带有羟基、酮基、醛基的半抗原，如醇、酚、糖、多糖、核苷以及甾族激素等，它们都不能直接与载体连接，需要用化学方法在半抗原上引起羧基后才能与载体连接。③芳香族半抗原由于环上带有羧基，它邻位上的氢很活泼，极易取代。

半抗原和载体连接的方法在一般实验室皆可完成，但反应条件应严格要求，以防半抗原失活或载体严重变性（一般变性并不妨碍）。

1．碳化二亚胺法碳化二亚胺是一种化学性质非常活泼的双功能试剂，常用的水溶性碳化二亚胺化学名为1-乙基-3-（3-二甲氨基）-碳化二亚胺盐酸盐。它可与半抗原的羧基、也可与其氨基结合，反应如下：+

此连接方法十分简便，只需将载体蛋白质和抗原按一定比例混合在适当的溶液中，然后加入水溶性碳化二亚胺，搅拌1～2h，置室温24h，再经透析即可。

2．戊二醛法戊二醛也是常用的双功能交联剂，它借两端的醛基与载体和半抗原的氨基以共价键连接，其反应如下：

蛋白质-NH₂+半抗原-NH₂+COH-(CH₂)₃-COH→蛋白质-N=CH-(CH₂)₃-CH=N-半抗原

3．氯甲酸异丁酯法该法又称为混合酸酐法，是利用半抗原上的羧基和载体蛋白上的氨基以肽链相连接，方法简便，多用于类固醇抗原的制备，其反应如下：

（三）无羧基和氨基半抗原衍生物的制备

某些类固醇和药物，需加以适当的改造，使其转变为带有羧基或氨基的衍生物。依据半抗原的性质有如下4种方法。

1．琥珀酸酐法琥珀酸酐是琥珀酸的脱水产物，遇水又可恢复。如果将带有羟基的半抗原化合物和琥珀酸酐在无水的吡淀中反应，就可得到带有羧基的半抗原琥珀酸的衍生物。再经碳化二亚胺可氯甲酸异丁酯法，制备载体半抗原。制备衍生物的反应如下：

2．O-（羧甲基）羧胺法带有酮基的半抗原与O-（羧甲基）羟反应，转变为带有羧基的半抗原衍生物。反应式如下：

半抗原-C=O+H₂N-O-CH₂COOH→半抗原-C=N=O=CH₂-COOH

3．一氯醋钠法带有酚基的半抗原，可用一氯醋酸钠法，生成带有羧基的半抗原衍生物。其反应式如下：

4．重氮的对氨基苯甲酸法先将对氨基苯甲酸和亚硝酸钠反应，反应产生再作用于带有酚基的半抗原，获得带有羧基的半抗原衍生物。反应式如下：