一、溶血反应的检测试剂

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(一)补体

检测血清补体水平或补体活性时需要从受检者采血及分离血清。做补体结合试验时多采用豚鼠血清作为实验用补体的来源。因为补体在体外极易衰变,所以检测补体活性的血清标本和作为补体试剂的血清必须新鲜。

受检者一般做静脉采血,在动物可做心脏采血。血清分离后应及时使用,最好在当日用完。必须保存时采用小量分装的办法,置-70℃下可保存数月,避免反复冻融。冻干制品可长期保存,但其活性都不同程度地比新鲜血清降低。

以豚鼠血清作补体来源时,应考虑到个体差异。为了确保血清中补体的有效活性,必须取3只以上豚鼠的血清混合后使用。

(二)绵羊红细胞

从绵羊颈静脉无菌采血,抽出血液后立即小心地注入放有玻璃珠的无菌干燥三角烧瓶中,充分旋摇15~20min,以除去纤维蛋白。也可将羊血与等量或2倍量的Alsever血液保存液混合,既有抗凝作用,又适于储存;分装后置4℃,可使用3周。

实验前,取适量抗凝血,加入8~10倍的生理盐水,轻轻混匀后2000r/min离心5min;弃上清,沉淀的红细胞用生理盐水再洗一次,这时上清为无色澄清,如显红色说明有溶血现象,应更换新鲜羊血;第三次用缓冲液洗涤,弃上清,取压积红细胞用缓冲液配制SRBC悬液,使用浓度一般为2%~5%。为使红细胞浓度标准化,可吸取少量红细胞悬液,中入20~30倍的稀释液中,在542nm波长比浊,以吸光度为标准调整红细胞浓度。

(三)溶血素

溶血素即抗绵羊红细胞抗体,多是以绵羊红细胞免疫家兔而得到兔抗血清。一般没有必要进一步提纯抗体,但在试验前需先进行加热56℃30min或60℃3min以灭活补体。

由于补体溶血试验及补体结合试验均是比较精密的试验,其结果与溶血素的效价有关,所以试验需要滴定溶血素效价;在制备抗血清的过程中,于动物采血前和分离抗血清后也需要滴定溶血素效价。

1.溶血素稀释稀释溶血素时,要先对效价有个大概的估计,以便确定稀释度的范围。动物采血前滴定时稀释范围要稍大些,实验前的滴定便以原先的记录作为参考(溶血素的效价多在数千单位以上)。溶血素稀释一般不采用连续倍比稀释法,因为稀释到最后时跨度太大,不容易确定单位。为了便于操作,现举例按表14-1配制不同稀释度的溶血素。

表14-1不同浓度溶血素的配制

最终稀释度缓冲液(ml)所加溶血素
稀释度体积(ml) 
1:10001.81:1000.2
1:20000.21:10000.2
1:30000.41:10000.2
1:40000.21:20000.2
1:50000.81:10000.2
1:60000.21:30000.2
1:80000.21:40000.2
1:100000.21:50000.2

2.效价滴定将稀释好的溶血素及其他试剂按表14-2所示逐步加入到各试管中,放置37℃水浴,不要盖上水浴箱的盖子,以免盖子上冷凝的水蒸气滴入试管内引起非补体性溶血。30min后取出观察结果。

表14-2溶血素的滴定

管号溶血素稀释度试管内加的各种试剂材料结果
溶血素(ml)1:60稀释补体(ml)缓冲液(ml)20%羊红细胞(ml) 
11:10000.10.20.20.1全溶
21:20000.10.20.20.1全溶
31:30000.10.20.20.1全溶
41:40000.10.20.20.1全溶
51:50000.10.20.20.1大部分
61:60000.10.20.20.1微溶
71:80000.10.20.20.1不溶
81:100000.10.20.20.1不溶
9(对照)0.50.1不溶

温育反应后,完全溶血的试管内液体红色透明,放置一段时间后管底无细胞沉淀,离心后可见少许细胞碎渣。不溶血的管内液体浑浊;放置后可见红细胞沉淀,上清无色透明。不同程度的不完全溶血介于两者的中间变化态。

按照以上标准,以产生完全溶血的最高稀释管为最大有效反应管,以该管的溶血素稀释倍数为溶血素产效价。例如表14-2中的溶血素效价应为1:4000;在1:4000稀释的情况下,反应液中所含溶血素的的量为1U/ml。

做补体活性测定或补体结合试验时,一般使用2U/ml溶血素(在本例做1:2000稀释),与SRBC悬液等体积混合。

(四)稀释缓冲液

磷酸缓冲液或巴比妥缓冲液等均可用于溶血试验,pH值应调至7.2~7.4之间。另加入适量氯化钠以保持等渗,并适当地加入一些钙离子和镁离子,这是补体活化所不可缺少的。有的配方还加入0.1%的明胶以使蛋白溶液稳定;加入0.01%NaN3可以防腐,利于较长时间保存。

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