森林脑炎疫苗制造及检定规程

森林脑炎疫苗系用森林脑炎病毒“森林”株接种于地鼠肾单层细胞，培育后收获病毒液，加入甲醛溶液将病毒灭活后制成。用于预防森林脑炎。

1　毒种

1.1　毒种来源

卫生部长春生物制品研究所保存之冻干毒种“森林”株。每3～5年会同中国药品生物制品检定所应用新分离的流行株病毒攻击，检测“森林”株的保护力，以了解该毒株的有效性。

1.2　毒种检定

1.2.1　无菌试验

毒种启封及每次传代后，均需做无菌试验，合格者方可使用。

1.2.2　病毒滴定

每正代必须用小白鼠进行脑内滴定。滴度≥9.0LogLD50/1.0ml方可用于生产。

1.2.3　纯毒试验

生产前须用小白鼠脑内法做中和试验鉴定毒种的特异性，中和指数必须在500以上。生产中如对毒种有怀疑，应及时进行鉴定。

1.3　毒种传代

分正亚代传递。传递代数正代不得超过15代，传代时选用体重10～12g健康小白鼠或乳鼠。每次毒种传代不得少于3个鼠脑。脑内接种病毒，72小时后选择眼结膜正常，有典型战栗、痉挛、肢体麻痹的小白鼠，处死后无菌取脑，并进行无菌试验。如发现污染者，应及时废弃。

1.4　毒种保存

鼠脑毒种收剖经无菌试验后立即保存于-60℃以下，无菌试验通过后方可使用。亦可将鼠脑毒种研磨乳化制成10%脑悬液，分装小瓶，冻存于-60℃以下，无菌试验合格后备用。

冻干毒种保存在2～8℃。

森林脑炎病毒“森林”株属二类毒种，必须设专人按有关规定负责管理，使用前、后记录清楚。

2　疫苗制造

2.1　细胞制备

2.1.1　地鼠

选用2周龄左右的健康地鼠。如发现肾脏异常或有乳糜状腹水，应废弃。

2.1.2　细胞消化及培养

处死地鼠，无菌取肾，加入适量胰蛋白酶液消化。用营养液分散细胞，制备细胞悬液，分装培养瓶，于37℃进行培养。营养液中牛血清含量不得超过8%。

2.1.3　外源因子检查

每生产批细胞留5%（或不少于500ml）悬液作为对照细胞检查外源病毒。该细胞除不接种病毒外，细胞尝试和处理均与生产过程平行进行。至原液收获之日，用显微镜观察，应无病变发生。并用0.2%～0.5%豚鼠红细胞（4℃保存不超过7天）进行血吸附试验，置4～8℃30分钟判定结果；再置20～25℃30分钟再次判定结果，均应为阴性。如有可凝病变或血吸附可疑阳性，在同种细胞上继续盲传，如传出病毒，该批细胞制备的疫苗应予废弃。

2.2　病毒接种和培育

2.2.1　生产毒种配制

将鼠脑毒种解冻乳化，制成10%～20%脑悬液，离心，取上清液作为毒种。亦可用冰冻鼠脑毒种悬液感染细胞。

2.2.2　病毒接种和培育

选择生长良好的细胞瓶，充分喷洗细胞后，加入适量含有病毒的营养液（病毒量不得大于7.0LogLD50/1.0ml），在适当温度下培育适当时间，弃去病毒培养液，换以新维持液，继续培育一定时间。

2.2.3　疫苗生产过程中不得加青霉素或其他β内酰胺类抗生素。

2.3　原液

2.3.1　病毒灭活

选择有典型细胞病变的培养瓶，经肉眼检查无菌者进行澄清过滤，按瓶取无菌试验及病毒滴定样品，取样后立即加甲醛溶液和硫柳汞，使甲醛的最终浓度为0.05%，硫柳汞为0.005%，置适当温度下灭活。

无菌试验为接种琼脂斜面培养基，3天判定，长菌者废弃。

2.3.2　过滤合并及取样

单瓶无菌试验未长菌、灭活到期、病毒滴定合格的疫苗进行过滤合并，摇匀后做无菌试验，取安全试验和效力试验样品。

安全试验每批合并检定疫苗量不得超过15万ml，效力试验每批合并检定疫苗量不得超过100万ml。检定批号和成品批号应一致。

2.3.3　原液检定

2.3.3.1　无菌试验

按《生物制品无菌试验规程》进行。

2.3.3.2　病毒滴定

将滴定样品做10倍系列稀释，取至少3个稀释度，每个稀释度病毒液脑内接种体重7～9g小白鼠4只，每只0.03ml，逐日观察，14天判定结果（3天内非特异性死亡者不计，）滴度≥7.0LogLD₅₀/1.0ml判为合格。不合格者可重试一次。

每个滴定批代表疫苗量不得超过15万ml。

2.4　半成品检定

2.4.1　灭活试验

（1）动物法：将样品脑内接种体重12～14g小白鼠8只，每只0.03ml，同时腹腔接种0.5ml，为第一代；7天后将第一代小白鼠处死3只，取脑做成10%悬液，脑内接种6只小白鼠，为第二代；7天后将第二代小白鼠处死3只，同法接种6只小白鼠，为第三代。每代小白鼠从接种之日起逐日观察14天，在观察过程中全部健存为合格，接种后3日内非特异性死亡者不计。

若传代3日后有个别小白鼠死亡，应立即取死鼠脑乳化成悬液再接种3只小白鼠，观察14天，该3只小白鼠健存仍判为合格。如仍有小白鼠死亡，该批疫苗应重试，重试合格后仍可使用。若传出活病毒应重试，查明原因。必要时继续灭活并进行灭活试验，若仍传出活病毒，该批半成品应予废弃。

（2）细胞培养-动物法：将样品50ml装入透析袋内，放入6000～8000ml维持液中于4℃透析24小时，接种地鼠肾细胞或BHK21细胞，每ml样品接种不少于3cm²的细胞片，置培养病毒的温度下培育14天，全部健存判为合格。若有死亡者应查明原因或重试，重试合格者仍可使用，不合格者应废弃。

以上两种灭活试验方法可任选一种。

2.4.2　残余牛血清蛋白含量测定

用检定所认可的试剂和方法测定，残余牛血清蛋白含量应≤50ng/ml。

2.4.3　效力试验

每批疫苗腹腔免疫体重10～12g小白鼠35只，于第1、3、5日共免疫3次，每次每只小白鼠0.3ml。另取同批小白鼠35只作为空白对照。于第10日以“森林”毒种0.3ml进行腹腔攻击，每天观察1次，观察21天判定结果。对照组LogLD₅₀/0.3ml在7.5以上，免疫保护指数达100000以上为合格。不合格者可重试1次。

3　成品检定

3.1物理检查

疫苗应为橘红色透明液体，无异物。

3.2　化学检查

按《生物制品化学检定规程》进行。pH值为7.2～8.0。游离甲醛不高于0.05%，硫柳汞不高于0.01%。

3.3　无菌试验

按《生物制品无菌试验规程》进行。

3.4　安全试验

每批疫苗腹腔注射体重18～20g小白鼠4只，每只0.5ml，逐日观察，3日内全部健存判为合格。如有小白鼠死亡，除检查原因外，应立即进行重试。

3.5亚硫酸氢钠检定

分装后亚硫酸氢钠要进行含量测定和无毒性试验。含量不得低于原配浓度的60%。无毒性试验系将样品稀释成1∶100，腹腔注射体重18～20g小白鼠2只，每只0.5ml，观察5日，应全部健存。

4　保存与效期