冻干基因工程α2a干扰素制造及检定规程

本品系用带有人α2a型干扰素基因重组质粒的大肠杆菌，经发酵培养及单克隆抗体亲和层析后精制而成。用于治疗某些病毒性疾病及部分肿瘤疾病。

1　菌种

1.1菌种来源

基因工程α2a干扰素工程菌由带有人α2a干扰素基因的重组质粒转化大肠杆菌而来。投产的工程菌需经卫生部批准。

1.2菌种特性

菌种表达稳定，表达水平符合投产菌种要求。

1.3制造用菌种库的建立

从原始菌种库传出，经扩大后冻干保存，或由上一代制造用菌种库传出，扩大后冻干保存作为制造用菌种库，但每次只限传三代。每批制造用菌种库均进行下列检定，合格后方可投产。

1.3.1划种LB琼脂平板

应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。

1.3.2涂片革兰氏染色

在光学显微镜下观察，应为典型的革兰氏阴性杆菌。

1.3.3对抗生素的抗性

应与原始菌株相符。

1.3.4电镜检查

应为典型大肠杆菌形态，并证明无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。

1.3.5生化反应

应符合大肠杆菌生物学性状。

1.3.6干扰素的表达量

在摇床培养，应符合原始菌种的表达量。

1.3.7质粒检查

应做该质粒的酶切图谱，并应与原始质粒相符。

1.3.8表达的干扰素型别

应用标准抗α干扰素血清做中和试验，证明型别正确。

1.4生产菌种

从制造用菌种库传出供生产用的菌种，称为生产菌种。

1.4.1生产菌种的制备及检定

取制造用菌种库冻干菌种开启后划种LB平板2～3块，培养后挑取平板中5～10个菌落，分别培养后保存，然后每个菌落分别进行干扰素表达量测定，至少重复一次，选出其中干扰素表达量最高的一份，供生产制备种子液用，其表达量应符合原始菌种的表达量。

1.5种子液

从生产菌种选出的菌种供做发酵用的称“种子液”。种子液的制备：将1.4.1项检定合格的生产菌种，根据实际需要做扩充传代，作为罐培养的种子液。

2　发酵培养

2.1空罐灭菌和实罐灭菌严格按照使用说明书要求操作。

2.2发酵培养基

应为适于发酵培养的培养基，根据菌种的抗生素抗性，培养若中允许加入少量抗生素，但应尽量避免含有β椖邗０防嗫股亍?/P>

2.3发酵培养参数

根据工程菌和发酵工艺要求设置和变换各项培养参数。

3　收集菌体

用离心法或其他适宜方法收集菌体，菌体可在?/FONT>20℃下保存1年。

4　菌体裂解

用盐酸胍或溶菌酶或高压匀浆泵等适宜方法裂解菌体。

5　制备粗制干扰素

菌体裂解后经离心所得上清液即为粗制干扰素。

6　纯化

粗制干扰素经单克隆抗体亲和层析等纯化步骤后即精制成“干扰素半成品原液”。

7　加白蛋白

取干扰素半成品原液检定合格后，立即另入适量人白蛋白保护剂，即为“加人白蛋白半成品”，保存于?/FONT>30℃。

8　稀释、除菌过滤

将“加人白蛋白半成品”用无热原生理盐水稀释至所需浓度，补加人白蛋白，使最终含量1%～2%。然后用0.22μm孔径滤膜除菌，除菌后抽样进行干扰素效价测定，热原质试验和无菌试验，合格后进行分装冻干。

9　分装、冻干

9.1　每支安瓿分装1ml，内含α2a干扰素100或300万IU。

9.2　冻干过程制品温度不得超过33℃。

9.3　冻干后成品置10℃以下干燥处保存，成品检定合格后进行包装。

10　半成品检定

每批半成品抽样进行10.1～10.8项检定。启开新菌种生产的前3批或生产条件有较大改变时进行10.9～10.12项检定。

10.1　效价测定

用细胞病变抑制法，Wish细胞/VSV为基本检测系统，用国家参考品校准为IU。

10.2　蛋白含量

用Lowry法测定。

10.3　比活性

应≥108Iumg蛋白。

10.4　纯度

10.4.1　电泳纯度

用非还原型SDS?/FONT>PAGE法，加样量不低于5μg，经扫描仪扫描纯度应在95%以上，聚合体不得超过10%。

10.4.2　高效液相色谱纯度

用280nm检测，应是一个吸收峰或主峰占总面积95%以上。

10.5　分子量

用还原型SDS?/FONT>PAGE法，加样量不低于5μg，α2a干扰素分子量应为19KD±10%。

10.6　残余外源性DNA含量

用同位素或生物素标记探针法测定，每剂量中残余外源性DNA应低于100pg。

10.7　残余鼠IgG含量

用酶标或其他敏感方法测定，每剂量（20μg）的鼠IgG含量应在100ng以下。

10.8　残余工程菌蛋白含量

用酶标或其他敏感方法测定，残余工程菌蛋白不得超过总蛋白的0.02%。

10.9　残留抗生素活性

半成品中不应有残余抗生素活性存在。

10.10　肽图测定

应符合α2a型干扰素图形，批与批之间图形应一致。

10.11　等电聚集

测定等电点，α2a型干扰素等电点应5.7～6.7范围内。

10.12　紫外光谱扫描

检查半成品的吸收光谱，批与批之间应一致，α2a干扰素的最大吸收光谱应为280±3nm。

11　除菌半成品检定

11.1　效价测定

同10.1项。

11.2　无菌试验

按《生物制品无菌试验规程》进行。

11.3　热原质试验

按《生物制品热原质试验规程》进行，注射剂量按家兔体重注射20万IU/kg，判定标准按该规程4.1项要求进行。

12　成品检定

12.1　外观

应为白色或微黄色疏松体，另入1ml灭菌注射用水溶解后，不得含有肉眼可见的不溶物。

12.2　pH值

pH值应为6.5～7.5。

12.3　效价测定

同10.1项。其效价应为标示量的80%～150%。

12.4　水分含量

应≤3%（g/g）。

12.5　鉴别试验

用中和试验法，其抗病毒活性能被抗α2a型干扰素血清所中和或用免疫印染法。

12.6　HBsAg检测

用敏感度为1ng/ml以下的试剂盒测定，应为阴性。

12.7　无菌试验

同11.2项，每批抽样不少于10支。

12.8　热原质试验

同11.3项。

安全试验

12.9.1　豚鼠试验

用体重300～400g豚鼠2只，每只腹侧皮下注射干扰素1ml，观察7天，局部无红肿、坏死、体重增加者为合格。

12.9.2　小白鼠试验

用体重18～20g小白鼠5只，每只腹腔注射干扰素0.5ml，观察7天，动物全部存活，每只体重增加判为合格。

13　保存与效期

保存于10℃以下干燥处。自效价检定合格之日起效期为2年6个月。