冻干黄热活疫苗制造及检定规程

本品系用减毒的黄热病毒17D株接种鸡胚，经研磨、离心，取上清液冻干制成。专供进入或经过黄热流行地区的人员预防黄热之用。

1　毒种

1.1　毒种来源

减毒黄热病毒17D株。

1.2　毒种检定

1.2.1　无菌试验

按《生物制品无菌试验规程》进行。

1.2.2　纯毒试验

用已知黄热病毒免疫血清做中和试验，证明其为黄热病毒。

1.2.3　猴体安全及效力试验

取冻干黄热17D毒种，加无菌生理盐水恢复其原液量，接种无黄热病毒中和抗体之恒河猴10只，每只脑内注射0.25ml（50000个小白鼠LD₅₀）。注射后第2、4、6日各采血1次，分离血清，分别做10倍系列稀释。以原血清及10^-1～10^-3各稀释度的血清分别脑内注射体重10～12g小白鼠6只，每只0.03ml，观察21天，检查病毒量，LD50均不得超过Log2（4天以内死亡的小白鼠不计算在内）。猴子经注射后2～4周，再采血1次，分离血清，做中和抗体测定。10只猴中至少要有9只血清表现阳性中和反应。在1个月的观察期中，发现脑炎症状或因而死亡者不得超过1只猴。

1.3　毒种保存

原毒种和生产毒种批均应冻干后真空封口，保存于-70℃以下。

1.4　毒种传代和生产毒种的制备

取毒种3支，启开安瓿后立即以稀释液（不应含有任何人体蛋白和外源血清或抗体）溶化。待全部溶化后接种于7日龄鸡胚卵黄囊，每胚0.2ml。分2组进行，每组不得少于10胚，置37.5～38℃培育。70～80小时按组收取活存鸡胚，每组不得少于4胚。去眼后分组混合研磨，加稀释液做成悬液，经2000r/min离心10分钟，吸取上清液，在鸡胚中传代，并抽样按《生物制品无菌试验规程》进行无菌试验。按同法连续传递2代，传代时可不等无菌试验结果，第3代毒种的鸡胚收获后，吸取容器内液体做无菌试验（方法同上），并将鸡胚冻存于-40℃以下。将无菌试验阴性之鸡胚取出融化。按每胚加入1ml稀释液研磨，经2000r/min离心10分钟，吸取上清液，加入稀释液稀释5倍后置冰浴中待用。同时做毒力滴定。此代即为生产毒种。

2　疫苗制造

2.1　接种鸡胚

用7日龄鸡胚，每胚接种适当稀释度毒种液0.1～0.2ml于卵黄囊，接种后滴蜡封口。

2.2　培育

接种后37.5～38℃培育，70～80小时开始收获。

2.3　收获

收获时剔去死胚，分组收获活存鸡胚，去眼，装入大管中，逐管吸取管内液体做无菌试验，在操作过程中盛鸡胚之大管应置冰浴中保冷，收获完毕置-40℃冻存。

2.4　研磨、离心

2.4.1　研磨

剔除洒菌鸡胚，将冰冻鸡胚大管置冷水中融化，倒入研磨桶内，按每胚1ml加入灭菌双蒸水，用电动研磨机8000r/min研磨3分钟。

2.4.2　离心，收取上清液

将研磨后的鸡胚悬液以减压虹吸法分装于500ml瓶中，塞以胶塞，用2000r/min离心30分钟。离心应在2～5℃进行。

收取上清液，每批装一个球瓶，换以胶塞，保存在冰浴中。

2.5　半成品检定

2.5.1　无菌试验

按《生物制品无菌试验规程》进行

2.5.2　冻干前病毒滴定

吸取球瓶中样品，作10倍系列稀释。取10-1～10-6之病毒液，每个稀释度用体重10～12g小白鼠6只，每只脑内注射0.03ml，接种部位忌用碘酒消毒，观察21天，计算LD50。

2.6　分装

疫苗保存在冰浴中进行分装，每安瓿分装量为0.5ml（10人份）。分装后将盛安瓿之金属盒放入-40～-50℃预冻2小时。

2.7　冻干

全部冻干过程为15～17小时，最后5小时升温20～25℃，最高不得超过25℃。冻干后安瓿真空封口。

3　成品检定

3.1　物理检查

外观为略带粉红色的疏松体，水分不应超过3%（g/g），加入稀释液应迅速溶解。

3.2无菌试验

按《生物制品无菌试验规程》进行。

3.3　猴体安全及效力试验

方法及要求见1.2.3项，如生产毒种做过猴体安全及效力试验则疫苗可免做。

3.4　豚鼠安全试验

按原分装量加入生理盐水溶解疫苗，用体重300～500g豚鼠2只，试验前2～3天每天量体温、称体重。然后每只腹腔注射0.5ml，观察7天，每天量体温，应无病症发生。如2只豚鼠均有显著反应（体温超过40℃，体重减轻）或死亡，则该批疫苗应废弃；如有1只豚鼠有症症发生，可再用3只豚鼠重试，重试中如有2只以上豚鼠发病时，判为不合格，制品应废弃；如有1只发病，则再重试，仍有发病则判为不合格，制品应废弃。

3.5　病毒滴定

同半成品检定。每只小白鼠脑内注射0.03ml。病毒滴度应≥3.66LogLD50。

3.6　稳定性试验

由每批疫苗成品取3安瓿，置37℃2周，滴度下降不应超过1Log。

3.7　鉴别试验

每亚批成品应按1.2.2项进行鉴别试验。

3.8　稀释液

氯化钠注射液，其质量应符合《中国药典》规定。

4　保存与效期

应保存于-20℃，自干燥之日起效期为1年半，如保存于2～8℃，效期为6个月。