血源乙型肝炎疫苗制造及检定规程

《中国生物制品规程》书籍目录

本品系由无症状HBsAg携带者血浆提取的HBsAg,经纯化、灭活及加佐剂吸附后制成。用于预防乙型肝炎

1 血源

1.1 对献血员的要求

1.1.1 献血员应为20~50岁无症状HBsAg携带者,其肝功能应无显着异常,并稳定。对献血员的其他要求按《原料血浆采集(单采血浆术)规程》执行。

1.1.2个月接种过活疫苗,1年内接种过狂犬病疫苗者,均不采血。

1.1.3 必要时以免疫扩散法(ID)测定HBsAg亚型。血源应以ad亚型为主,可有少量ay亚型。

1.2 单份血浆检查

1.2.1 无菌试验

按《生物制品无菌试验规程》进行。

1.2.2HbsAg测定

用对流电泳法测定,HBsAg滴度应≥1∶8,或用反向血凝法(RPHA)测定,滴度应≥1∶1024。

1.3 混合血浆检查

1.3.1支原体检查

按《生物制品无菌试验规程》进行。

1.3.2 取样接种孔雀绿培养基,35~37℃培养28天,结果应为阴性。

1.3.3 外源病毒检查

用Vero细胞和人二倍体细胞各3瓶,每瓶容量为10~15ml,各接种0.2ml样品,35~37℃培养10天,应无病变出现。用0.2%~0.5%鸡与豚鼠红细胞等量混合后于37℃吸附1小时,测定血吸附反应,应均为阴性。

2 抗原的浓缩和变化

2.1 血浆脱纤维

于血浆中加入氯化钙溶液,使之脱纤维。

2.2硫酸铵沉淀

于血清中加入硫酸铵饱和溶液,或用固体硫酸铵,使最后达到适宜的饱和度,沉淀HBsA.

2.3 超离心纯化

溴化钾等密度区带离心2~3次,每次离心后分部收样,根据紫外监测峰及密度测定,合并合格的样品,经超滤去盐浓缩。蔗糖速率区带离心1~2次,分离出HBsAg。

3 灭活

3.1 胃酶处理

将HBsAg悬液加入适量胃酶,置35~37℃处理4~5小时,最后超滤去胃酶。

3.2 尿素处理

于HBsAg悬液中加尿素至4~8mol/L置37℃处理4~5小时,超滤去尿素。亦可不用尿素处理。

3.3福尔马林灭活

于HBsAg悬液中按1∶4000加入福尔马林,置37℃72~96小时。不用尿素处理者可用1∶2000福尔马林灭活。

4 稀释与吸附

已灭活的疫苗原液经除菌过滤后,根据Lowry法检测折算的特异性蛋白含量进行稀释,加入A1(OH)3吸附,并于疫苗内加入防腐剂。

5 半成品检定

5.1 总蛋白含量测定

用Lowry法测定,使用检定所提供的标准品。

5.2HBsAg含量测定

按总蛋白含量将样品稀释至不同稀释度,用RIA或火箭电泳法测定,使用检定所提供的标准品,HBsAg含量应在90%以上。

5.3 电镜检查

取每台离心机每次蔗糖离心后的样品,制作5个铜网,在60000倍电镜下,每个铜网观察6个视野,结果应主要为22nm球形颗粒,未见Dane颗粒为合格。有可疑Dane颗粒者应以加倍视野数检查。

5.4 残留杂蛋白检查

5.4.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳法

浓缩胶浓度为4%,分离胶为7.5%,加10μgHBsAg样品和适量的人血清白蛋白进行电泳,银染,试验样品应不出现明显杂蛋白带

5.4.2SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法

HBsAg样品经SDS处理后在7.0%浓缩胶和15%分离胶中加入5μg进行电泳,结果在分离胶中应主要存在22000及28000分子量带,应不出现明显的杂蛋白带。

5.5HBV DNA检查

用HBv DNA片段制备探针,取200μg除菌后的样品与探针进行杂交,结果应为阴性。控针的灵敏度应≤1pg。

5.6 无菌试验

按《生物制品无菌试验规程》进行。

6 分装

每支安瓿分装1.0ml,HBsAg含量分别为10μg和30μg两种规程。

7 成品检定

7.1 无菌试验

按《生物制品无菌试验规程》进行。

7.2 安全试验

每亚批疫苗皮下注射体重14~16g小白鼠,每只0.5ml,注射后第3天和第7天各观察一次,允许皮下有硬结,但应健存。

7.3 化学检定

按《生物制品化学规定规程》进行。

7.3.1pH值测定

应为5.5~6.8。

7.3.2 游离甲醛测定

应含游离甲醛,但含量应≤0.01%。

7.3.3 氢氧化铝含量测定

每ml应不超过1.25mg。

7.3.4 氯化钠含量测定

应为0.8~0.95%。

7.3.5硫柳汞含量测定

不应超过0.01%。

7.4 效力和鉴别试验

将疫苗4倍递增稀释,每个稀释度接种BALB/cH2d或NIHq型雌性小白鼠20只,每只腹腔注射1.0ml,4~6周后采血,以RIA法测定抗-HBs,计算小白鼠ED50值与参比苗ED50值,结果以检品ED50值/参比ED50值,其比值≥1为合格。

7.5 抗-HBc检测

每批用6只体重为300~350g同性豚鼠,每只腹部皮下注射疫苗0.5ml,间隔一个月免疫第2次,之后一个月心脏采血,用RIA法检测免疫前后血清,结果抗-HBc应阴性,否则应重试。

7.6人体免疫观察及标准

每年度生产的头3批疫苗或前、中、后各一批疫苗进行人体免疫观察,观察对象为小学生或学龄前儿童,按0、1、2个月程序每批至少接种20人,每人于上臂三角肌肌内注射1.0ml,于3针接种后一个月采血,用RIA法测定三项指标,抗-HBs阳性率(S/N≥10)大于90%,6个月内未出现HBsAg者判为合格,否则需要重试。对免疫后单独出现高滴度抗-HBc者应分析原因。

8 保存与效期

保存于2~8℃暗处,不得冻结。自检定合格之日起效期为2年。

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