附录　WHO推荐的白喉类毒素效价测定方法

更新：【中医宝典App】2021-04版免费下载 >>>

可选用以下两种方法之一种进行。

（一）Vero细胞测定抗体法

1　免疫与采血

用生理盐水将吸附白喉类毒素标准品和待检样品以2倍稀释法稀释成3～5个适当稀释度，每一稀释度样品免疫体重10～14g小白鼠8只，皮下注射0.5ml，免疫5周后，每个小白鼠采血，分离血清，56℃30分钟灭活，放-20℃保存。

2　毒素试验量测定

Vero细胞测定白喉抗体试验时毒素试验量采用Lcd/10000。

在96孔培养板中用RPMI1640（或199）培养液将毒素做2倍系列稀释，每孔50μl，然后向各孔中加入50μl标准白喉抗毒素（0.0001IU），用胶带密封，在室温放置1小时后，加入50μlVero细胞悬液（见3项）密封，放37℃CO2孵箱培养6～7天后，观察结果，使细胞死亡的最大毒素稀释度孔（红色）就是Lcd/10000。

Lcd/10000的毒素量约相当于1×10^-4Lf的毒素适用于本试验。

3　Vero细胞

RPMI1640（或199）培养液（加青霉素100IU/ml，链霉素100μg/ml，胎牛血清10%）。Vero细胞培养于150cm²培养瓶中，待细胞长成占瓶底80%～100%单层时，弃去上层培养液，加10ml0.25%胰酶，放37℃数分钟，弃去胰酶，加入10ml培养液，打匀细胞进行计数（1瓶150cm²培养瓶大约可得10～40×10⁶细胞）。用培养液调整细胞浓度至2.5×10⁵细胞/ml。

4　阳性对照小白鼠血清

用吸附白喉类毒素免疫1批小白鼠，免疫5周后采血，分离血清，分装小管，冷冻干燥，保存于-20℃。

5　抗体滴定

按下图将培养板编号：

A1　A2　A3　A4　A5　A6　A7　A8　A9　A10　A11　A12

（1）向每孔加入50μl培养液，但A11、A12和H11、H12孔不加，而G11、G12加100μl培养液。

（2）取8份待检血清，分别加入A1至H1孔各50μl，横向进行2倍系列稀释，直至A10和H10孔。

（3）将标准白喉抗毒素稀释至0.008IU/ml，加入A11、A12、B11和B12孔各50μl，从B11和B12孔开始竖向做2倍稀释至D11和D12孔。

（4）H11和H12孔加入阳性小白鼠对照血清50μl。

（5）除G11和G12孔外，向其余各孔中加入毒素（Ldc/10000）50μl，轻轻转动培养板，混匀，在培养板上贴上胶带将板孔封闭，放室温1小时。

（6）收集Vero细胞，进行计数，并稀释成2.5×细胞/ml的Vero细胞悬液。

（7）室温放置1小时之培养板，去胶带，立即加入50μlVero细胞悬液，再用胶带封闭培养板，放37℃CO2孵箱培养6天。在24小时及48小时检查胶带封闭情况，如出现封闭不严应更换。

（8）培养6天后取出培养板，根据培养液颜色变化记录结果，黄色为（+），红色为（-），羲色不明显者则可用显微镜观察，如单层细胞完整无损则为（+），否则记录（-）。最终结果以打分表示，即变成黄色的最高稀释度孔的2的指数，例如：变黄的最后一孔是1/256即2⁸，则结果记为8。

6　试验要求

E11、E12、F11和F12孔代表毒素量和Vero细胞敏感度都出现（-），如果出现（+），则毒素量和细胞敏感度都很低，应重试。

细胞孔G11、G12和阳性对照孔H11、H12必须是（+），如出现（-），应重视。

Lcd/10000毒素量的准确性，根据以上计划下列各孔中所加标准抗毒素为：

孔A11和A120.0004IU

B11和B120.0002IU

C11和C120.0001IU

D11和D120.00005IU

如毒素用量准确（Lcd/10000），则A11、A12和B11、B12孔应为（+），而C11、C12和D11、D12应为（-），否则应重试。

7　结果计算

用平行线分析法进行结果计算

8　结果判定

待检样品的效价每剂量应不少30IU。如95%可信限大于50%～200%，则95%可信限的低限效价应大于30IU/1个人用剂量。

（二）豚鼠毒素攻击法

1　免疫及攻击

用生理盐水将吸附白喉类毒素标准品和待检样品稀释成等比间隔的3～5个稀释度（中间的稀释度必须在攻毒后能保护约半数动物），每一稀释度样品免疫体重250～300g之豚鼠至少10只，另外5只豚鼠不注射作为对照。免疫后4周，每只免疫豚鼠攻击白喉毒素100LD₅₀，皮下注射1.0ml。对照组健康动物注射100倍稀释之上述毒素，每只皮下注射1.0ml。攻击毒素后观察5日，每日记录结果。

2　试验成立应具备的条件

（1）检品的最低稀释度能保护半数以上动物。

（2）检品的最高稀释度保护半数以下动物。

（3）对照组动物应部分死亡而不全部死亡。

（4）检品和标准品的剂量反应曲线在平行性及直线性上没有太大的偏差。

3　结果计算及结果判定

见Vero细胞法7和8项。