附录2　精制抗狂犬病血清3效价（IU）测定方法

1　中和用病毒悬液的制备

要求中和用病毒悬液经37℃水浴作用1小时的LD₅₀在32～320之间。

1.1病毒株的选择：选用CVS毒种。

1.2　病毒株的传代：取CVS毒种（一般为冻干毒种）制成10-2悬液，脑内接种体重10～12g健康小白鼠0.03ml，待发病后取脑再制成10-2悬液，接种于小白鼠脑内进行传代，一般传至2～3代即可制成冻干中和用病毒或–70℃冻存的中和用病毒，但要选用小白鼠在第5天发病并麻痹的服制备。

1.3　冻干病毒的制备：用第5天发病并麻痹的鼠脑以脱脂牛乳研磨稀释成20%的脑悬液，按0.5ml分装安瓿冻干后真空封口，存-30℃待用。

1.4-70℃冻存病毒的制备：用第5天发病并麻痹的鼠脑用20%小牛血清磷酸盐缓冲液研磨稀释成10-1悬液，经2000r/min20分钟沉淀，取上清混匀后分装小管，存-70℃冰箱待用。

1.5　病毒悬液的预测

1.5.1冻干病毒的预测：取含20%脑悬液的冻干病毒，启开后加入含2%小牛血清PBS1.0ml，吹打均匀后再用4.0ml上述稀释液与病毒液充分混匀，1500r/min沉淀10分钟，取上清与等量的稀释液混合则为10^-2悬液，然后再用10^-3、10^-4、10^-5、10^-6稀释，从10^-6至10^-2各取0.5ml加入5个小管内，每管再加入2%小牛血清PBS0.5ml，放置37℃水浴一小时。用体重10~12g小白鼠30只，分成5组，每组6只，经用37℃作用的10^-6至10^-2病毒悬液接种小白鼠，每个稀释度接种6只小白鼠，每只小白鼠脑内接种0.03ml，观察14天，每天观察小白鼠发病死亡情况，接种后4天内死亡的小白鼠按非特异性死亡计。以接种5天后的发病死亡小白鼠统计LD50。

1.5.2-70℃冻存病毒悬液的预测：取含10%脑悬液的冰冻病毒用流水融化后即为10-1悬液，然后再做10-2至10-7稀释。从10-7至10-3各取0.5ml加至5个小管内，每管再加入2%小牛血清PBS0.5ml，放置37℃水浴1小时，用体重10～12g小白鼠30只，分成5组，每组6只，用经37℃作用的10^-7至10^-3病毒悬液接种小白鼠，每个稀释度接种小白鼠6只，每只小白鼠脑内接种0.03ml，观察14天，每天观察小白鼠发病死亡情况。接种后4天内死亡的小白鼠按非特异性死亡计。以接种5天后的发病死亡小白鼠统计LD₅₀。

1.5.3按以上二种病毒的悬液预测的结果计算LD₅₀。将用其100个LD₅₀的病毒稀释度作为中和用病毒悬液稀释倍数，用于小白鼠中和试验。

2　小白鼠的准备

用作中和试验的小白鼠必须是未进行过其他试验的健康小白鼠，体重为10～12g。

3　中和试验

3.1狂犬病血清中和试验用的血清参考标准品：由中国药品生物制品检定所提供，或用经检定所认可的各生产单位工作用参考标准品。

3.2待检定血清样品的稀释：取有代表性的血清样品，按二倍连续稀释的方法用2%小牛血清PBS进行稀释，一般可采用1∶800、1∶1600…1∶102400，但可根据血清实际效价的情况适当减低或提高试验时最低稀释倍数，如采用上述8个稀释倍数，则用待检血清按2.7ml稀释液加入0.3ml血清作为1∶10，然后再用3.5ml稀释液加入混匀的1∶10倍的血清0.5ml为1∶80，再按2.7ml稀释液加入0.3ml为1∶800。然后均按0.5ml加0.5ml稀释的方法制成1∶800、1∶1600…1∶1024008个稀释倍数，以上8个稀释倍数的不同稀释度分别以0.5ml加入8个小试管内待用。

3.3　效价检定用血清标准品的稀释：方法同待检血清样品的稀释。如用检定所的85RS国家标准品，稀释度应从1∶80开始，其国际单位为26.53/ml。

3.4　中和用病毒悬液的制备：按病毒悬液预测的100个LD50的稀释度作为中和用病毒悬液。

3.5　中和：将上述3.2项的8个稀释度的各装0.5ml的8支小试管和3.3项的8个稀释度的各装0.5ml的8支小试管共16支小试管各加入中和用病毒悬液0.5ml，放置37℃水浴1小时，作注射小白鼠用。另用相同体重的小白鼠测定中和用病毒悬液的实际LD50。其方法可将中和用病毒悬液作为原液再稀释10-1、10-2、10-3四个稀释度，以上4个稀释度各加入0.5ml于小管内，每管再加入2%小牛血清PBS0.5ml，同样放置37℃水浴1小时作为中和病毒对照。

3.6接种小白鼠：将已中和的待检血清和血清标准品的不同稀释度的悬液和病毒对照接种小白鼠，血清按从浓到稀的倍数接种小白鼠，而病毒对照则按从稀到浓的倍数接种小白鼠。每只小白鼠脑内接种0.03ml。

3.7　观察：共观察14天，每天记录小白鼠的发病死亡情况，接种后4天死亡的小白鼠作为非特异性死亡计。

4　待检血清效价

按下列公式计算：

相对效力=待检血清ED50的倒数/血清标准品ED50的倒数

血清效价（IU/ml）=相对效力×血清标准品的国际单位