二、PCR的特点

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(一)特异性高:首次报导的PCR所用的DNA聚合酶是大肠杆菌的DNAPolymeraseI的Klenow大片段,其酶活性在90℃会变性失活,需每次PCR循环都要重新加入Klenow大片段,同时引物是在37℃延伸(聚合)易产生模板—引物之间的碱基错配、致特异性较差,1988年Saiki等从温泉水中分离到的水生嗜热杆菌中提取的热稳定的Taq DNA聚合酶,在热变性处理时不被灭活,不必在每次循环扩增中再加入新酶,可以在较高温度下连续反应,显着地提高PCR产物的特异性,序列分析证明其扩增的DNA序列与原模板DNA一致。扩增过程中,单核苷酸的错误参入程度很低、其错配率一般只有约万分之一,足可以提供特异性分析,选用各型病毒相对的特异寡核苷酸引物。PCR能一次确定病毒的多重感染。如用HPV11和HPV16型病毒引物检测病妇宫颈刮片细胞可以发现部分病人存在HPV11和HPV16两型的双重感染。

(二)高度敏感:理论上PCR可以按2n倍数扩增DNA十亿倍以上,实际应用已证实可以将极微量的靶DNA成百万倍以上地扩增到足够检测分析量的DNA。能从100万个细胞中检出一个靶细胞,或对诸如病人口液等只含一个感染细胞的标本或仅含0.01pg的感染细胞的特异性片段样品中均可检测。

(三)快速及无放射性:一般在2小时内约可完成30次以上的循环扩增,加上用电泳分析。只需3-4小时便可完成,不用分离提纯病毒,DNA粗制品及总RNA均可作为反应起始物,可直接用临床标本如血液、体液、尿液、洗液、脱落毛发、细胞、活体组织等粗制的DNA的提取液来扩增检测,省去费时繁杂的提纯程序,扩增产物用一般电泳分析即可,不一定用同位素,无放射性易于推广。

(四)简便:扩增产物可直接供作序列分析和分子克隆,摆脱繁琐的基因方法,可直接从RNA或染色体DNA中或部分DNA已降解的样品中分离目的基因,省去常规方法中须先进行克隆后再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的组织或切片亦可检测。如在PCR引物端事先构建一个内切酶位点,扩增的靶DNA可直接克隆到M13,PUC19等相应酶切位点的载体中。

(五)可扩增RNA或cDNA:先按通常方法用寡脱氧胸苷引物和逆转录酶将mRNA转变成单链cDNA,再将得到的单链cDNA进行PCR扩增,即使mRNA转录片段只有100ngcDNA中的0.01%,也能经PCR扩增1ng有242碱基对长度的特异片段,有些外显子分散在一段很长的DNA中,难以将整段DNA大分子扩增和做序列分析。若以mRNA作模板,则可将外显子集中,用PCR一次便完成对外显子的扩增并进行序列分析。

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  3. PCR法《生物化学与分子生物学》
  4. PCR操作范例《实用免疫细胞与核酸》
  5. PCR反应的基本条件及其对PCR的影响《基因诊断与性传播疾病》
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  7. PCR方法《基因诊断与性传播疾病》
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  9. PCR缓冲液《实用免疫细胞与核酸》
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  11. PCR技术的原理《实用免疫细胞与核酸》
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  13. PCR介导的信号转导途径《细胞和分子免疫学》
  14. Parinaud氏综合征《神经精神疾病诊断学》
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  16. PAP免疫电镜双重标记《实用免疫细胞与核酸》
  17. PCR实验中常见问题对策《基因诊断与性传播疾病》
  18. PAP法《实用免疫细胞与核酸》
  19. PCR仪器的发展《实用免疫细胞与核酸》
  20. PAP包埋前染色法(Pickel 等,1975)《实用免疫细胞与核酸》
  21. PCR应用领域《实用免疫细胞与核酸》
  22. PAP包埋后染色法《实用免疫细胞与核酸》
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  30. PaO[XB]2[/XB]下降,Paco[XB]2[/XB]升高,二者变化不成一定比例关系《病理生理学》
  31. PE-标记蛋白A方法《实用免疫细胞与核酸》

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