人胃螺旋菌的分离培养研究

人胃螺旋菌(Gastrospirillumhominis,GH)是近来人们认识到的除幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, Hp）外的另一类与人胃炎有关的微生物，国内报道人群感染率明显高于国外。由于目前国内外对GH尚未分离培养成功，对Gh的研究仅限于组织学及形态学观察，影响了对Gh本身及其致病性方面的深入认识。我们自一接受胃镜检查的病人中，观察到有Gh和Hp混合感染存在，并最终纯化分离到了Gh和Hp。在对Gh的传代培养中，我们较系统地观察了不同培养条件及冷冻保存对其形态等的影响。现简要报告如下。

1 材料和方法

1.1 标本来源

实验标本来源于一位在首都医学院附属天坛医院接受胃镜检查的50岁的男性病人，病理学检查证实其胃粘膜是中度慢性浅表性胃炎伴中度活动性胃炎表现。胃镜检查时在胃窦部钳取胃粘膜组织2块，置于含10%小牛血清的布氏肉汤中，放于4°C保存4d后进行以下实验。

1.2 胃粘膜组织尿素酶试验

参考Christensen尿素肉汤培养和Morris等快速诊断法，采用2%液体尿素常规法，于4h及24h观察结果。

1.3 细菌分离培养及纯化

在灭菌研磨器中将胃粘膜组织研磨成匀浆，涂于含6%脱纤维绵羊血的布氏琼脂平板（含TMP5mg/L，万古霉素6mg/L及多粘菌素B4mg/L）中，将平板置于含10%CO2₂、5%O₂及85%N₂的混合气体培养箱中，37°C培养3d后涂片，在光镜下观察培养结果。在含10%脱纤维绵羊血的布氏琼脂平板中进行Gh菌单菌落纯分离，并测定其尿素酶、氧化酶及过氧化氢酶活性。

1.4 不同培养条件下Gh生长情况

①将纯化的Gh菌分别接种于含6%与10%脱纤维绵羊血的布氏琼脂平板中，置混合气体环境，37°C培养3d，涂片检查细菌形态。②将纯化的Gh菌接种于含6%脱纤维绵羊血的布氏琼脂平板中，局部分别滴加灭菌的布氏肉汤、新鲜脱纤维绵羊血及冻融脱纤维绵羊血，并分别加盖一片灭菌的盖玻片，使覆盖部位呈厌氧状态。放37°C培养3d，观察细菌菌落生长情况及涂片观察细菌形态。③将纯化的Gh菌接种于含10%小牛血清的布氏肉汤小管中（管口加灭菌绵塞），放混合气体环境，37°C培养3d后，直接涂片及离心沉渣涂片观察细菌形态。④将置于保存液（含10%蔗糖和50%小牛血清）中，-70°C保存30d后的Gh菌，接种于含10%脱纤维绵羊血的布氏琼脂平板中，37°C培养3d后，观察菌落生长情况、涂片观察细菌形态、测定其尿素酶、氧化酶和过氧化氢酶活性，并继续传代观察其形态变化。

2 结果

胃粘膜组织尿素酶试验4h及24h均为阴性。细菌初代培养物涂片发现含有Gh和Hp两种菌。经单菌落分离分别得到Gh和Hp菌的纯培养，其中分离到的Gh菌株命名为Gh32。对Gh32的测定发现其氧化酶与过氧化氢酶均为阳性。并含有很强的尿素酶活性。Gh32在含有6%脱纤维绵羊血的布氏培养基上生长较差，菌落呈针尖状。光镜下可见细菌呈球形、肾形及短螺旋形，多数菌仅一个弯曲。在含10%脱纤维绵羊血的布氏培养基上生长良好，可长成1mm～2mm直径单个菌落，光镜下可见细菌呈多螺旋状，螺旋数目在1～6个之间，且螺旋较密。Gh32在盖玻片下生长不良；在滴加布氏汤和未滴加任何液体的对照部位，细菌菌落较小，呈针尖状。在滴加新鲜血或冻融血而未被盖玻片覆盖处，菌落形态及光镜下细菌形态与在含10%脱纤维绵羊血布氏琼脂平板上生长的情况相似。Gh32在液体培养时生长较慢，3d后液体仅轻度混浊，涂片发现细菌数目较少，但菌形良好，螺旋数在3～14个不等，长度可达17μm左右。经3，000r/min（台式离心机上）离心3min后沉渣用少许生理盐水悬浮涂片发现，多数细菌螺旋数在4～6个左右。将低温保存Gh32初代复活时，菌落生长良好。酶活性检查发现，其尿素酶、氧化酶及过氧化氢酶均为阳性。涂片发现几乎所有菌体均发生了球形变。连续传代2次后，70%左右恢复典型形态，连续传代3次后细菌几乎全部恢复其典型形态。

3 讨论

人们对胃螺旋菌的认识已有一个较长的历史过程。早在1881年Rappin就报道在狗胃粘膜中观察到螺旋形细菌的存在，此后又有许多在其它哺乳动物胃粘膜中观察到螺旋形细菌存在的报道。1906年Krienitz首先观察到人胃粘膜中有3种不同类型的弯曲或螺旋细菌存在，但此后胃螺旋菌未能引起人们的足够重视。随着对幽门螺杆菌与胃炎及消化性溃疡的关系的深入研究，人们开始重新对人胃螺旋菌进行认识。目前认为此菌可能为除Hp外的又一类与胃炎有关的细菌。自1987年来世界各地已有近百例有关Gh感染的报道，国内杨海涛等也曾报道14例Gh感染病人。人们自猪等动物已成功地分离到了胃螺旋菌，近年来国内外多位学者曾对Gh进行分离培养，但至今未见有关Gh培养成功的报道，对Gh的研究也仅限于对病理组织学的观察。我们自人胃粘膜组织中成功地分离到一株Gh，为对Gh的深入研究创造了必要条件。

虽然目前我们只分离到一株Gh菌，可能不能完全反映所有Gh菌所需要的培养条件，但我们在实验中观察到了Gh菌形态的易变性。在不同培养条件下，Gh可呈1～14个螺旋不等，甚至呈肾形或球形。Gh在培养条件不完全适合时，不能表现出其典型形态，而胃粘膜标本中往往有多种细菌存在，在选择性培养基上也可能不止有一种细菌生长，对形态不典型的Gh菌，很容易被当成杂菌或Hp菌处理。我们在分离猪胃螺旋菌(Gastrospirillumsuis)时也曾发生类似情况，一度将一株猪胃螺旋菌作为幽门螺杆菌样细菌（Helicobacter pylori like organism,hpLO）处理过，后来在半固体及液体培养时才观察到其典型形态。Gh在人群中的感染率相对较低（仅1%左右），更增加了Gh分离培养成功的难度。我们认为以上因素可能是造成以往分离培养Gh失败的主要原因。这提示人们，在作Gh分离培养时，如观察到可疑Gh菌存在时，应增加培养基中含血量或进行液体培养，以便使Gh表现出其典型形态。由于Gh在固体培养基中菌形较短，而在液体培养时，虽菌形良好，但菌量较少，有关Gh的最适培养条件问题，仍需进一步探讨。

实验表明，Gh为微需氧菌，氧化酶和过氧化酶均为阳性，且有很高活性的尿素酶，而在胃粘膜组织直接尿素酶活性检测时则为阴性，这可能与胃粘膜中Gh菌量较少有关。提示胃粘膜组织尿素酶阴性的依据，也不能反映Gh产生尿素酶活性的强弱。

实验发现本病人胃粘膜中有Gh与Hp混合感染，两菌同时感染的机会较少，目前仅有数例报道。病人经组织学证实胃粘膜呈中度慢性浅表性胃炎伴中度活动性胃炎表现。Gh在胃炎发生过程中所起的作用如何，有待进一步研究。Gh的传染和传播途径问题、Gh与猪、狗、猫胃螺旋菌间的关系，以及在胃内这一特定微生态环境中Gh与Hp的关系等均有待于进一步探讨。Gh的培养成功，使对这一系列问题的研究成为可能。