(三)限制性片段长度多态性

《生物化学与分子生物学》书籍目录

随着对基因认识的不断深入,发现在同种生物的不同个体之间,尽管其蛋白质产物的结构和功能完全相同或仅存在着细微的差异,但在DNA水平却存在着差异,尤其在不编码蛋白质的区域以及没有重要调节功能的区域表现更为突出。这种不影响生物体表型的DNA突变被称为中性突变。

分子生物学技术的不断发展已使得从DNA水平直接分析这类突变成为可能。

目前应用较多且成熟的方法是限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)。即当DNA序列中某一个碱基发生突变,使突变所在部位的DNA序列获得或丢失某种限制性核酸内切酶位点;或当DNA分子内部发生较大的顺序突变如缺失、重复、插入,或DNA高变区内某串联重复顺序的拷贝数不同致使其两侧限制性核酸内切酶位点发生相对位移时,利用相应的限制性核酸内切酶消化此DNA,便会产生与正常不同的限制性片段。这样,在同种生物的不同个体中就会出现不同长度的限制性片段类型。

因为DNA的中性突变常以孟德尔显性遗传方式遗传给下一代,所以对这类突变检测已广泛用于遗传病的诊断、产前诊断、亲子鉴定以及法医学上对罪犯的确认等。

(四)DNA序列分析(DNa sequencing)

DNA的一级结构决定了基因的功能,欲想解释基因的生物学含义,首先必须知道其DNA顺序。因此DNA序列分析是分子遗传学中一项既重要又基本的课题。

1986年由美国学者提出的,目前正在实施的人类基因组计划(human genome project),则是要通过对人类基因组3×109bp全序列的序列分析和人类基因的染色体图谱制定达到了解其结构,认识其功能,即从分子遗传学水平来认识人类自身的结构和功能特征的目的。

核酸的核苷酸序列测定方法已经过近20年的发展,因而测序的具体方法五花八门、种类繁多。但是究其所依据的基本原理,不外乎Sanger的核酸链合成终止法及Maxam和Gilbert的化学降解法两大类。虽然原理不同,但这两种方法都同样生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸,每组寡核苷酸都有固定的起点,但却随机终止于特定的一种或多种残基上。由于DNA链上每一个碱基出现在可变终止端的机会均等,因而上述每一组产物都是一些寡核苷酸的混合物,这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原DNA片段上的位置所决定。然后在可以区分长度仅相差一个核苷酸的不同DNA分子的条件下,对各组寡核苷酸进行电泳分析,只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道之上,即可从凝胶的放射自显影片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。以下分别介绍。

1.Sanger双脱氧链终止法

DNA的合成总是从5′端向3′端进行的。DNA的合成需要模板以及相应的引导核酸链。DNA的合成过程中,在合成的DNA链的3′末端,依据碱基配对的原则,通过生成新的3′,5′-磷酸二酯键,使DNA链合成终止,产生短的DNA链。具体测序工作中,平行进行四组反应,每组反应均使用相同的模板,相同的引物以及四种脱氧核苷酸;并在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸,使其随机地接入DNA链中,使链合成终止,产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。这四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开,经过放射自显影显示区带,就可以直接读出被测DNA的核苷酸序列(图15-3)。

双脱氧链终止法测定DNA序列原理示意

图15-3 双脱氧链终止法测定DNA序列原理示意

2.MaxamGilbert DNA化学降解法

这一方法的基本步骤为(1)先将DNA的末端之一进行标记(通常为放射性同位素32P;(2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰;(3)在修饰碱基位置化学法断开DNA链;(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开;(5)根据放射自显影显示区带,直接读出DNA的核苷酸序列(图15-4)。

化学裂解法测定DNA的核苷酸序列

图15-4 化学裂解法测定DNA的核苷酸序列

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  1. 限制性片段长度多态性《生物化学与分子生物学》
  2. 限制性片段长度多态性《医学遗传学基础》
  3. 限制性通气不足《病理生理学》
  4. 限制性核酸内切酶的作用《生物化学与分子生物学》
  5. 线胶《外科全生集》
  6. 限制性核酸内切酶的命名《生物化学与分子生物学》
  7. 线粒体《病理学》
  8. 限制性核酸内切酶的概念《生物化学与分子生物学》
  9. 线粒体基因组《医学遗传学基础》
  10. 限制性核酸内切酶的分类《生物化学与分子生物学》
  11. 线粒体抗体《实用免疫细胞与核酸》
  12. 限制性核酸内切酶《医学遗传学基础》
  13. 线形《气功外气疗法》
  14. 限制型心肌病《心脏病学》
  15. 线鱼鳔《本草撮要》
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  17. 线障《中医词典》
  18. 限制酶切片段长度多态性组织配型法《医学免疫学》
  19. 哯(xiàn现)乳《中医词典》
  20. 现况调查中的偏倚及其防止《预防医学》
  21. 《中医词典》
  22. 现况调查的种类《预防医学》
  23. 陷伏《景岳全书》
  24. 现况调查的方法《预防医学》
  25. 陷伏《中医词典》
  26. 现况调查《预防医学》
  27. 陷伏《张氏医通》
  28. 现况调查《流行病学》
  29. 陷伏倒靥《证治准绳·幼科》
  30. 现患率(prevalence rate)(亦称患病率)《预防医学》
  31. 陷谷《针灸大成》