三、聚合酶链式反应

如果已经知道目的基因的序列，就能很方便地用PCR聚合酶链式反应，polymerase chain reaction，从基因组DNA或cDNA中获得目的基因，可不必要经过复杂的DNA文库构建过程。PCR是70年代中期创立的技术，其基本原理如图20-10所示。

图20-10 PCR基本原理示意图

PCR反应系统包括含有目的基因或序列的DNA模板，对热稳定的DNA聚合酶，一对脱氧寡核苷酸引物、DNA合成所需要的4种脱氧核苷三磷酸以及保证聚合酶催化反应的Mg2+及缓冲液等。人工合成引物的序列设计是PCR成功的关键，一般两条引物的序列反应分别与欲获得的双链DNA两条链3’端的序列互补。先升高温度使模板DNA变性、双链分开；再降低温度退火使引物与模板DNA配对互补结合；然后升温到聚合酶反应适宜的温度，此时在聚合酶催化下，从引物3’羟基端开始，与模板DNA上的碱基配对逐个加上核苷酸，合成新的DNA链。其后再按高温变性、低温退火、适温合成三步反复循环，新合成的DNA在下一循环中又作为模板使用，每循环一次，合成的目的序列扩增一倍，而且很快扩增的序列主要限制在所设计的一对引物规定的模板序列范围内，一般循环30-40次，按理论计算，目的序列可扩增230-240倍，而实际上由于底物和引物的消耗，酶的失活等因素，产物量并不是始终以指数增加的，但通常实验获得目的序列106-108倍的扩增产物并不困难，因而PCR具有很高度的灵敏度，由于引物与模板的配对互补结合的特异的，因而PCR也具有高度的特异性。所以可以方便地用PCR在成千上万的基因序列中获得只有极微含量的特定目的基因或序列，PCR获得的目的序列产物连接在适当的载体上，转化受体细胞，经筛选就能得到目的序列的克隆。

现在PCR技术还在不断发展，已知部分序列或未知序列的基因有的也能设计PCR来扩增和克隆，模板核酸可用双链DNA，单链DNA，甚至RNA。由于PCR的高灵敏度和特异性，在基因诊断上有更广泛的应用，后面的章节还要叙述。